测序
2017-02-17 14:52:37 0 举报AI智能生成
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测序是一种用于确定生物体基因组、基因或其他DNA分子序列的技术。它通过将DNA分解成一系列小片段，然后对这些片段进行测序，最终将这些序列重新组合起来，以获得完整的DNA序列信息。现代测序技术包括Sanger测序、Illumina测序和Nanopore测序等，这些技术具有高通量、高精度和低成本等优点，被广泛应用于基因组学、医学研究、农业改良等领域。
作者其他创作
大纲/内容
测序
DNA测序
子主题
第一代DNA测序：Sanger法
核心：4管反应+ddNTP随时终止反应
未完待续。。。
第二代DNA测序
核心：边合成边测序
捕捉新合成的末端标记来确定DNA序列
技术平台
454FLX：测序片段长400bp
SOLID：测序准确度高：碱基准确度>99.94%
Solexa：性价比最高，454的1/10
原理
基本原理：边合成边测序
Sanger基础+不同颜色荧光标记的4种dNTP
DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放不同的荧光
捕捉荧光信号+特定的计算机软件处理
操作流程
1.测序文库的构建
样品准备
随机片段化
两头加上特定的接头
另外
RNA测序在这里相对麻烦
偏短的大小对分析有影响
2.锚定桥接
DNA片段单链与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构
3.预扩增
+dNTP+Taq酶固相桥式PCR扩增
单链桥型待测片段—双链桥型
变性，释放互补的单链，锚定到固相表面
4.单碱基延伸测序
+荧光标记的dNTP+DNA聚合酶+接头引物
测序仪捕获荧光信号+软件将光信号转化为测序峰
5.数据分析
原始数据：长度几十个碱基的序列
通过生物信息学工具组装、比对——获得生物学意义
测序由专门的商业公司完成
但了解原理和流程对后续的数据分析很重要
二代半测序平台——芯片测序
二代测序
RNA测序
高通RNA-Seq
技术背景
测序方法发展
第一代测序技术
Sanger法
Gilbert法
先特定的试剂标记碱基
化学方法打断代测序列
第二代测序技术
Roche公司的454
Illumina的Solexa
ABI的SOLiD
与第一代技术的比较
保持高准度，降低成本提高速率
测序结果长度较短
适合对已知序列基因组重新测序
对全新基因组还需要结合第一代技术
第三代测序技术
单分子测序
在单一DNA分子组成的阵列上进行合成测序
跨越了文库制备中基于PCR扩增的信号放大过程
达到了读取单个荧光分子的能力
RNA-Seq原理
技术优势
高通量、数字化、单碱基、背景低、基因表达范围>8000倍、RNA用量少
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多种技术方法
454
Solexa
SOLID
HeliScope
技术应用及前景
转录本结构（变异）研究
基因表达水平研究
非编码区域功能研究
低丰度全新转录本发现
问题及挑战
庞大的数据量带来信息学难题
对比鉴定同源基因
确定最佳测序量
获得高质量的转录图谱
识别和追踪罕见RNA亚型的表达变化
样品起始量的缩减
单细胞或少量细胞
单细胞RNA测序
分支主题4
分支主题5
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