基因工程
2017-02-18 07:56:33 0 举报AI智能生成
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基因工程
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大纲/内容
基因工程
发展过程
DNA是遗传物质的证明
DNA双螺旋结构和中心法则的确立
遗传密码的破译
基因运载体的发现
工具酶的发现
DNA的合成和测序技术的发明
DNA体外重组的实现
重组DNA表达实验成功
第一列转基因动物问世
PCR技术的发明
基因工程基本操作程序
目的基因的获取
定义
主要是指编码蛋白质的基因也可以是一些具有调控能力的因子
常见方法
从基因文库中获取
基因组文库
（cDNA)部分基因文库
真核DNA
某个时期mRNA反转
PCR增扩目的基因
原理
DNA双链复制
条件
引物 模板 Tap酶 dATP(四种脱氧核苷酸）
过程
裂解（90-95）
目的基因DNA受热变性解链为单链
退火（55-60）
引物与单链相应互补配对
延伸（70-75）
DNA聚合酶下进行延伸复制（2n次方个DNA分子
注意
温度控制
引物长短
过长难结合
过短特异性差不一定有目的基因
避免形成发夹撞和二聚体
GC碱基对含量
人工合成法
如果基因小 核苷酸序列已知 可用DNA合成仪用化学方法人工合成
难点
mPNA反转录过程中获得的基因库，为什么仅含有部分基因
基因的选择表达，部分基因转录出mRNA
比较cDNA文库和基因组文库
基因组文库＞cDNA 都是基因文库
PCR需要解旋酶吗？DNA聚合酶应具有的特点
不需要 高温解旋 能耐高温的DNA聚合酶
目的基因核苷酸序列如何得到的
测定目的基因的核苷酸序列 mRNA-DNA
基因表达载体的构建
目的
目的基因可以稳定存在遗传表达
组成
启动子
RNA聚合酶识别和结合的部位
终止子
RNA聚合酶脱离部位
标记基因
鉴别目的基因
复制原点
同种限制酶分别切割载体和目的基因 DNA连接酶连接
将目的基因导入受体细胞
导入植物细胞
农杆菌转化法
双子叶植物和裸子植物
基因枪
单子叶植物
花粉管通道法
导入动物细胞
显微注射技术
受精卵
导入微生物细胞
用Ca处理细胞 变成感受态
感受态吸收重组表达载体DNA分子
原核细胞
繁殖快 多为单细胞 遗传物质少
切割目的基因和载体要选用同种限制酶
产生相同黏性末端 目的基因与载体相连
实际用两种
防止反接自接
启动子终止子起始密码子终止密码子
启动终止在DNA 转录 起始终止在mRNA翻译
T-DNA能整合到染色体
有连接酶限制酶
目的基因的检测和鉴定
检测转基因生物目的基因DNA
DNA分子杂交
mRNA
分子杂交 提取mRNA
蛋白质
抗原抗体杂交
人为通过体外DNA重组和转基因技术赋予新遗传特性
基因工程是在DNA分子水平进行设计和施工的
转基因属于工程不等于基因工程
DNA重组技术的基本工具
限制性核酸内切酶（限切酶） 分子手术刀
来源
主要是从原核生物中分离纯化出来的
作用
识别双链DNA的特定核苷酸序列（回文序列）
切 4 （5）6 8
切割特定部位两个核苷酸之间的磷酸二酯键
切割不消耗能量 连接要
结果
黏性末端
平末端
有可能识别相同序列切出不同末端
有可能切相同末端来自不同序列
DNA连接酶 分子缝合针
Ecoli DNA连接酶
来自大肠杆菌
连接黏性末端
T4 DNA连接酶
T4噬菌体
形成磷酸二酯键
没有特异性识别 但有专一性
只连接DNA
基因进入受体细胞载体 分子运输车
类型
质粒
环状双键裸露的DNA分子
人 噬菌体的衍生物
动植物病毒
质粒主要来自原核生物
质粒合成毒素 色素 抗生素 激素
自我复制 遗传效应
自我复制或能整合到DNA上随染色体DNA进行同步复制
在受体细胞中稳定存在
有一个至多个限制酶的切点
便于外源DNA插入
标记基因（荧光）
供重组DNA鉴定和选择
基因工程的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么
有性生殖中是随机的只能在同种进行 基因工程可以在不同物种间重组 并且可以定向改变性状
不同生物DNA分子能拼接起来的原因
DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸
双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
所有生物的DNA碱基对均严格遵守碱基互补配对原则
外源基因能在受体内表达并使受体表现出相应的性状
基因是控制生物体性状的结构和功能单位 具有相对独立性
遗传信息的传递都遵循中心法则
生物界共用一套遗传密码
基因工程的载体和主动运输的载体有哪些区别
主动运输中虎穴本质是蛋白质 运输小分子进出细胞
基因工程载体本质DNA 携带目的基因进入细胞
载体必须对受体细胞无害
如果有害 会影响受体细胞生命活动甚至破坏
质粒切一刀 目的基因切两刀
未处理的大肠杆菌不能作为受体细胞
未处理的的大肠杆菌吸收质粒能力极弱
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