基因工程
2020-03-13 17:47:44 2 举报AI智能生成
基因工程 超级详细
作者其他创作
大纲/内容
基因工程的应用
植物基因工程
抗虫转基因植物
Bt毒蛋白基因 蛋白酶抑制剂基因 淀粉酶抑制剂基因 植物凝集素
优点
减少成本 减少污染
抗病
病原微生物的概念
引起植物生病的微生物
盐碱和干旱对农作物的危害与细胞的渗透压调节有关
利用转基因改善植物的品质
动物基因工程
提高动物的生长速度
改善畜产品的品质
用转基因动物生产药物
乳腺生物反应器
优点
产量高，质量好，成本低，易提取
缺点
必修是雌性动物，受性别限制；必须到成熟期才可以提取
膀胱生物反应器
不受性别限制，一出生就可以提取
用转基因动物做器官移植的供体
最大障碍：免疫排斥
基因工程药物
工程菌，生产药物
基因治疗
是治疗遗传病的最有效手段
将正常基因导入，正常基因和原有的缺陷基因都会表达，正常基因的表达产物掩盖了缺陷基因的表达产物
分类
健康人体中分离出来的正常基因
反义基因
编码可以杀死癌变细胞蛋白酶的基因，自杀基因
蛋白质工程
概念
以蛋白质分子的结构规律以及生物功能的关系作为基础，通过基因的修饰或基因的合成（作用于基因），对现有的基因进行改造，或制造出一种新的蛋白质，来满足人们需要（第二代基因工程）
原因
需要新的蛋白质，而基因工程只能产生原有的蛋白质
原理
中心法则的逆推
要改变蛋白质结构，还需要通过基因（而且稳定遗传）
基本途径
预期蛋白质的功能出发----设计蛋白质结构----推测应有的氨基酸序列--找到脱氧核苷酸序列
应用
提高酶的功能
人鼠嵌合抗体
t-PA治疗脑血栓 心肌无力
限制因素
高级结构十分复杂，了解不多
基本操作
一：获取目的基因
目的基因：编码蛋白质的基因，也可以是具有调控能力的因子
常用方法（3）
从基因文库中获取
基因组文库：文库大，含有一种生物全部的基因，有启动子和内含子
cDNA文库（部分基因文库，由某个时期的mRNA反转录形成）文库小，含有某种生物的部分基因，无启动子和内含子
利用PCR技术扩增
概念
多聚酶链式反应，一项在体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
原理
DNA复制
前提
一段已知目的基因的核苷酸序列
条件
引物（两种，一对，加在3’端：为Taq酶提供3’端）：一小段DNA或RNA分子，一般20~30个碱基，能与DNA母链的一段碱基互补配对
Taq酶（热稳定DNA聚合酶）
四种脱氧核苷酸
已知模板DNA（含有目的基因，两条链）
其他：温度，缓冲液...
过程
高温变性（90~95）
双链DNA模板在热作用下，形成单链DNA（热变性解旋，而不用解旋酶）
低温复性（55~60）
系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链
中温延伸（70~75）
在Taq酶作用下，合成与模板互补的DNA链（2的n次方）
循环，得到大量目的基因
注意
热稳定DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3’延伸DNA，DNA合成的方向总是从子链的5’向3’延伸
化学方法人工合成
用于基因比较小，核苷酸序列已知，可用DNA合成仪，化学方法人工合成
反转录法或者已知核苷酸序列合成DNA
方法比较
如果目的基因的核苷酸序列已知：PCR技术
如果对目的基因的碱基序列完全不知：从基因文库中获取
如果已知序列信息，基因比较小：人工合成
拓展
用于解旋
解旋酶（DNA复制
RNA聚合酶（转录
高温（高温变性，PCR
需要模板链
：PCR技术，反转录法
二.核心：基因表达载体的构建
包含
目的基因
启动子
RNA聚合酶识别与结合的位点，作用：启动转录
终止子
终止转录
标记基因
鉴别筛选作用
还有：复制原点
DNA复制的起点
目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以传给下一代，使目的基因能表达和发挥作用
注意点
使用了三种工具
会出现多种连接情况
注意
目的基因和运载体要用双酶切，保证目的基因定向连接，防止自身环化
不同载体的构建方法不用
启动子终止子（DNA的非编码区）RNA聚合酶识别与结合的位点
DNA转录
起始密码子（可以决定氨基酸）终止密码子（不能决定氨基酸）
mRNA翻译
过程
用限制酶切割质粒，使其出现一个缺口，露出粘性末端
用同种限制酶切割目的基因，使其产生相同的粘性末端
将切下的DNA片段插入质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，形成一个重组质粒
三：将目的基因导入受体细胞
导入植物细胞
农杆菌转化法
过程
将目的基因插入农杆菌的Ti质粒的T-DNA上
将目的基因的Ti质粒导入农杆菌
将含有重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞
目的基因随T-DNA插入到植物细胞的染色体DNA上
筛选出导入了目的基因的植物细胞
对含有目的基因的植物细胞进行植物组织培养
获得转基因植物后，进行个体水平的鉴定
归纳重点
两次拼接
目的基因与T-DNA
T-DNA与植物染色体DNA
两次导入
Ti质粒到农杆菌
农杆菌到植物细胞
需要用到的生物技术
基因工程技术
植物组织培养i技术
细菌培养技术
需要对宁杆菌进行钙离子的处理（氯化钙也可以）使之处于感受态细胞
适用于
双子叶植物或裸子植物
Ti质粒上有连接酶和限制酶
基因枪法
又叫微弹轰击法，使用金属颗粒成本高
适用于单子叶植物
花粉管通道法
简洁轻便我国独创
转化
目的基因导入受体细吧，并在受体细胞中维持稳定并表达的过程
导入动物细胞
显微注射法
注入受精卵
导入微生物
感受态细胞法
原核生物的特点
繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对计较少（最常用：大肠杆菌）
使用钙离子（氯化钙）处理，再让感受态细胞吸收重组DNA分子
四：目的基因的检测与鉴定
检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因
这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键
使用：DNA分子杂交技术（观察是否出现杂交带）
检测是否转录出mRNA
这是目的基因是否发挥作用的第一步
使用：分子杂交（观察是否出现杂交带）
是否翻译出蛋白质
抗原抗体杂交技术
提取的蛋白质相当于抗原
抗....的接种实验
是否抗.....
理论
外源基因在受体细胞中表达
生物界共用一套密码子
遗传都遵循中心法则
DNA能重组的原因
DNA分子都具有规则的双螺旋结构
概念
概念总览
按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
说明概念：
别名
基因拼接技术，DNA重组技术
操作概况
环境
生物体外
对象
基因
水平
DNA分子水平
特点
定向改造生物性状
原理
基因重组
优点
同杂交育种相比，克服了远缘杂交不亲和的障碍
同诱变育种相比：定向改造生物性状
最大优点
按照人们的意愿，定向改造生物的遗传性状
基本操作过程：剪切-拼接-导入-表达
基因工程与有性生殖的区别：有性生殖是随机的，只能在同种之间进行
三种工具（两种酶）
分子手术刀：限制性核酸内切酶（限制酶）
存在：
主要从原核生物中分离纯化出来的
作用
1·识别双链DNA分子特定的核苷酸序列（切4.5.6.8刀）2.切割每一条链上特定两个核苷酸之间的磷酸二酯键
结果
粘性末端（中心轴线两侧
平末端（沿中心轴线处
特点
特异性，专一性
切割部位
磷酸二酯键
关于酶切问题：
要想获得一段基因，必须用限制酶切2个切口，形成3个DNA片段，产生了4个末端（平末端或者粘性末端）
有可能识别序列相同，却切出不同末端
有可能识别序列不同，却切出相同末端
把两个来源不同的DNA片段用同种限制酶切割，会产生相同的粘性末端
拓展
注意：限制酶不能切割单链DNA和RNA，也不能识别
原核生物的限制酶不能切割自身DNA
没有识别序列
在甲基化酶的作用下，把甲基转移到碱基上（被修饰过
没有限制酶
原核生物中存在限制酶的意义
原核生物容易受到外源DNA的入侵，限制酶用于切割外源DNA，保证自身安全
切割不消耗能量，但是连接需要消耗能量
限制酶是一类酶，而不是一种酶
限制酶的切割位点应位于标记基因之外，不能破怀标记基因，以便于进行检测
分子缝合针：DNA连接酶
来源
E`coliDNA连接酶~大肠杆菌体内~用于连接粘性末端
T4DNA连接酶~噬菌体体内~连接粘性末端和平末端（效率低些
作用
形成磷酸二酯键（没有特异性识别，但专一只连接DNA
补充
分子运输车：基因进入受体细胞的载体
载体类型
最常用：质粒
概念
裸露的，结构简单的，独立于细菌拟核DNA之外的，并育有自我复制能力的很小的环装DNA分子
化学本质：DNA（没有蛋白质，不同于载体！）
来源：只存在于细菌或酵母菌中
复制
能在细胞中自我复制
整合到染色体DNA上，随染色体进行同步复制
被用于基因工程的质粒都是被人工改造过的
入噬菌体的衍生物
动植物病毒
目的
1·用它作为运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中
2·利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制
特点
要有一至多个限制酶的切割位点供外源DNA插入
含有复制原点，能在宿主细胞内自主复制（便于在宿主细胞中稳定存在）
含有特殊的标记基因，供重组DNA分子鉴定与筛选
对受体细胞无害
拓展
质粒与目的基因构建的重组基因，又叫做：重组DNA分子，基因表达载体
质粒切一刀（而目的基因切两刀）
未处理的大肠杆菌不能作为受体细胞（吸收质粒的能力弱）
关于各种酶的比较
关于DNA结构
关于基因
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