分子生物学
2021-01-30 09:34:52 18 举报AI智能生成
从DNA和RNA的角度，即分子的角度，阐述原核生物和真核生物的本质。 包括DNA的复制，转录，翻译，即后期的加工，原癌基因，抑癌基因，基因工程等，包括其所用的酶，转录因子等小分子， 《生物化学与分子生物学》
作者其他创作
大纲/内容
核酸
核酸的代谢
从头合成：利用磷酸戊糖，氨基酸（天冬氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸）一碳单位，CO2等简单物质，经过一系列酶促反应，合成核苷酸
嘌呤核苷：天冬氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，一碳单位，CO2，酶：磷酸戊糖焦磷酸合成酶PRPP,氨酰转移酶，——IMP（次黄嘌呤核苷酸）
IMP
AMP
ATP功能 激酶作用
ATP
GMP
ATP功能 激酶作用
GTP
嘌呤类似物：6-MP，谷氨酰胺：氮杂丝氨酸，叶酸类似物：甲氨蝶呤
尿酸：别嘌呤醇
嘧啶：谷氨酰胺，天冬氨酸，CO2，PRPP
先合成嘧啶，再加上PRPP，先合成UMP再转化
核苷三磷酸水平
氨基甲酰磷酸合成酶（CPSⅡ）,天冬氨酸氨基甲酰基转移酶
UMP ——UDP
UDP
dUDP
dUMP
dTMP
dTDP
dTTP
UTP
CTP
CDP
dCDP
dCMP
dUMP
核苷一磷酸水平
5-FU，阿糖胞苷，环胞苷
嘌呤：直接与PRPP反应，先合成IMP
嘧啶：先成环，在与prpp反应，现场生成：UMP
补救合成：利用体内游离的嘌呤核苷和嘧啶核苷，经过简单反应，生成核苷酸
嘌呤核苷酸：以中间代谢物PRPP，腺嘌呤，次黄嘌呤，鸟嘌呤，为原料，在腺嘌呤磷酸核糖转移酶APRT；次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶HGPRT，腺苷激酶，
自毁容貌症
嘧啶+PRPP，尿嘧啶核苷+ATP，脱氧胸腺嘧啶核苷+ATP
核酸的结构和功能
原核生物
DNA复制
过程
起始
DNA 解链 → 引物合成 → 起始复合物形成 → DNA聚合酶Ⅲ 聚合DNA链
复制固定起点：oriC，DnaA蛋白质辨认结合 → DnaB（解旋酶）+（DnaC协助）解链 → 置换出DnaA蛋白 → 复制叉 → SSB（单链结合蛋白）使复制叉保持复制的长度
拓扑异构酶 Ⅱ 把正超螺旋转变为负超螺旋
拓扑异构酶 Ⅱ 把正超螺旋转变为负超螺旋
引物 （RNA分子） → 引物酶（RNA聚合酶）→ 方向 5’-3‘ 留下3’-OH
因为DNA聚合酶不能形成两个游离的dNTP之间的磷酸二酯键，需要3‘-OH
起始复合物 ：解旋酶（DnaB+DnaC）+引物酶+DNA复制起始区域 → DNA上移动需要ATP
延长
前导链和后随链在同一个DNApolⅢ下催化，方向5‘-3’ → 后随链的模板DNA可以折叠或者绕为环状，使之与前导链对齐
终止
去除RNA引物换为DNA → 填补空缺 → 连接缺口
引物水解 ：DNApolⅠ，填补空缺 ：DNApolⅠ ；缺口链接 ：连接酶
子主题
RNA合成
酶：
RNA聚合酶：σ亚基和核心酶
转录
起始
聚合酶识别启动子——闭合转录复合体 → 双链打开-开放转录复合体-磷酸二酯键形成（GTP/ATP）→ 启动子清除
延长
核心酶参与，转录泡（核心酶，DNA，RNA）
终止
依赖ρ因子
不依赖ρ因子
蛋白质的合成
翻译起始复合物形成
核糖体大小亚基分离，起始因子IF123参与） → mRNA与小亚基结合（mRNA上有SD序列与16SrRNA识别结合） → 起始肽酰-tRNA结合在P位（IF1占据A位，IF2与Met与GTP结合然后再与P位结合） → 大亚基与其结合，GTP水解提供能量使IF123离开 → 翻译起始复合物形成（核糖体 mrna fMet）开始延长
在核糖体上进行三步反应延长肽链
进位：氨酰-tRNA与 GTP-EF-Tu形成复合物，再进入A位，→ GTP水解 EF-Tu从核糖体释放，可以循环
EF-ts是ef-Tu的调节亚基
核糖体对进位有校正作用
成肽：肽酰转移酶（23Srna）属于核酶：起始肽酰与新和成肽酰的α-氨基端合成肽键，所以肽链从N端到C端形成，此时，二肽位于A位，P位trna不携带氨基酸，进入转位
转位：需要EF-G（转位酶）：核糖体向3端移动一个密码子的距离，P位到E位，脱落，A位到P位，使得A位空缺，GTP水解提供能量
终止密码子和释放因子导致肽链合成
核糖体A位与mRNA上的终止密码子对应 ：终止密码子不对应任何氨酰，而是释放因子RF与之对应。RF1，RF2特意识别终止密码子并且将肽酰转移酶变为酯酶——使得核糖体构想发生改变，酯酶可以水解酯键使得肽链从tRNA上脱离，RF3具有GTP酶活性，使得，mRNA，tRNA，RF也从核糖体释放。
蛋白质合成后的加工和靶向运输
分子伴侣
基因表达
乳糖操纵子
乳糖操纵子
特点：基因组：环状超螺旋，重复序列少，单拷贝基因，编码蛋白质的基因为连续基因，；结构基因多余真核；操纵子为 特有，转录和翻译同时进行，
操纵子
结构基因
产生的mRNA称为多顺反子
功能上相关，串联排列，共用一个启动子和转录终止信号
调控序列
启动子：启动元件
共有序列，结合RNA聚合酶，TATAAT盒子—-10区；TTGACA--35区
操纵元件
能被特异的阻遏蛋白识别并结合的DNA序列，负性调节，
调节基因
编码与操纵元件结合的阻遏蛋白，负性调节，
子主题
其他蛋白质
特异因子
激活蛋白（CAP）
乳糖操纵子
结构
结构基因
Z基因
β-半乳糖苷酶
Y基因
通透酶
A基因
乙酰基转移酶
调控序列
启动子P
上游有CAP结合位点
操纵序列：O
调节基因：I
编码阻遏蛋白结合调控序列
调节
阻遏蛋白
子主题
CAP（激活蛋白）
cAMP与葡萄糖的浓度变化呈反比
cAMP与CAP结合使其发挥作用
葡萄糖阻遏乳糖操纵子的表达
分解代谢阻遏
诱导剂：别乳糖（别乳糖类似物：IPTG）
有葡萄糖没有乳糖：无转录
有葡萄糖和乳糖：少转录
无葡萄糖有乳糖：转录
有葡萄糖和乳糖：少转录
无葡萄糖有乳糖：转录
真核生物
DNA复制
染色质：核小体
组蛋白/DNA
4种碱性组蛋白（H）
核心组蛋白：8个组蛋白分子（H2A,H2B,H3,H4）个2个
组蛋白H1，核心组蛋白上DNA链进出口处，维持核小体稳定
核心颗粒
核心组蛋白与DNA组成
连接段DNA：连接相邻核小体，非组蛋白结合区域
子主题
子主题
子主题
RNA合成
酶：RNA聚合酶
聚合酶 Ⅰ Ⅱ Ⅲ
Ⅰ
核仁：rRNA前体，俄膏蕈碱不敏感
Ⅱ
最活跃：前体mRNA很敏感
最大亚基：RPBⅠ
CTD，RPBⅠ的羧基末端
CTD磷酸化在转录起始发挥重要作用
Ⅲ
核仁外：tRNA，5SRNA，snRNA，较敏感
转录
起始
TFⅡB-TBP复合体 + RNAⅡ-TFⅡF复合体 = 闭合复合体——转录起始前复合物 → （TFⅡH）开放复合体，CTD磷酸化启动转录
延长
终止
蛋白质合成
有3端帽子和5端的尾巴
翻译起始复合物
翻译起始复合物的形成：43S起始复合物（起始因子eIF，氨酰，核糖体小亚基）eIF1结合于E位，3防止大小亚基过早结合，1A进入核糖体，1A占据A位，eIF2-GTP-Met + eIF5,5B形成43S起始前复合物
mRNA与小亚基结合：eIF4F复合物（eIF4A,E,G）（A:ATP酶活性和RNA解旋酶活性)（E：结合5端帽）（G结合eIF3，4E,PABP）：4F使得mrna和小亚基结合
大亚基结合：48S复合物——（mRNA + eIF4F + 43S起始前复合物） → 48复合物扫描mRNA A进行 → eIF5B有GTP酶活性，水解供能使得起始因子解离，eIF2具有GTP酶活性使得Met与小亚基结合。（eIF5促进2的反应）
延长
进位
成肽
转位
基因表达
细胞间广泛存在信号通讯网络
特点
基因组庞大；编码基因少，断裂基因（内含子和外显子），mRNA单顺反子，染色质结构；有线粒体DNA，
调节
染色质结构
常染色质/异染色质：活性染色质，超敏位点（转录活化区域：裸露DNA）
活性染色质，超敏位点（转录活化区域：裸露DNA）
组蛋白发生变化：使得染色质松弛：甲基化，乙酰化，磷酸化，泛素化修饰，ADP-核糖基化
化学修饰发生：组蛋白尾巴：
组蛋白密码假说：组蛋白的修饰直接影响染色质和核小体结构；募集其他调控转录基因的蛋白质。
CpG岛：甲基化水平降低：使得转录。甲基化水平高：染色质结构紧密，
表观遗传
转录起始
RNA聚合酶需要与多个转录因子作用，完成起始复合物的装配
调控序列
顺式作用元件
启动子
TATA盒子，（-25~-30区域），GC盒子，CAAT盒，
典型Ⅱ型启动子：TATA+GC+CAAT
核心启动子：富含TAAT盒
核心启动子：富含TAAT盒
不含TAAT盒
有GC
没有GC
增强子
提高转录效率；作用与序列无关
沉默子
抑制基因转录，阻遏作用，不受序列方向影响，
绝缘子
阻遏增强子或沉默子的作用，方向无影响，
调节分子
转录因子
通用
基本转录因子
特异
子主题
结构特点
DNA-蛋白质/蛋白质-蛋白质 调节
转录起始复合物组装
技术
分子杂交与印迹技术
分子杂交：
印迹技术和探针技术
类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，
探针：检测样品中存在的特定核酸分子；带有可检测标志物的核酸片段，具有特定序列，可以与核酸片段碱基互补
DNA印迹
southern blotting：消化-分离-变性-转移-固定-杂交-检测
RNA印迹
northern blotting：与DNA相似，不用酶切消化，变性：甲醛
蛋白质印迹
western bblotting：免疫印迹，第一抗体，第二抗体
PCR技术
聚合酶链式反应
体外模拟体内DNA复制过程
模板DNA ，特异引物，耐热性DNA聚合酶，dNTP,含有镁离子的缓冲液
变性 → 退火 → 延申
用途
获取目的基因
DNARNDA微量分析
DNA序列分析
基因突变分析
基因的体外突变
衍生技术
逆转录PCR：RNA逆转录和PCR联合使用，
原位PCR：完整的细胞，扩增细胞内的目的基因 → 将目的基因与定位技术相结合 ，细胞进行通透性处理
实时PCR:引物探针类实时PCR
基因芯片
同一时间内分析大量基因。双色荧光探针杂交
原癌基因与抑癌基因
概述
与肿瘤发生密切相关：原癌基因，抑癌基因，基因组维护基因
原癌基因活化/抑癌基因失活导致细胞生长增殖失控；基因组维护经验：间接，可以属于原癌基因
原癌基因
SRC;RAS;MYC家族
SRC：ABL，酪氨酸激酶
RAS：低分子量G蛋白，失去GTP酶活性
MYC：转录因子
活化机制：基因突变；基因扩增；染色体易位；获得启动子/增强子
编码蛋白质
与生长因子密切相关
生长因子：内分泌，自分泌，旁分泌 → 正相调节靶细胞生长 → 通过信号转导发挥其作用
原癌基因编码的蛋白涉及生长因子信号转导的多个环节
细胞外生长因子
跨膜生长因子受体
细胞内信号转导因子
核内转录因子
编码的蛋白质也可以属于生长因子或生长因子受体
抑癌基因
肿瘤抑制基因：阻止或防止癌症发生
对细胞增殖起负性调节作用
抑制细胞增殖；抑制细胞周期进程；调控细胞周期检查点；促进凋亡；参与DNA损伤修复
失活机制
特点
作用隐性；两个等位基因全部失活导致抑癌作用丧失；单倍体不足型抑癌基因；显性复效突变
基因突变导致抑癌基因编码的蛋白质功能丧失或降低：功能失去突变
杂合丢失导致抑癌基因彻底失活
启动子区甲基化导致抑癌基因表达抑制：CpG岛
RB：视网膜母细胞瘤基因：通过调控细胞周期检查点而发挥其抑癌功能
TP53：基因组卫士，通过调控DNA损伤应答和诱发细胞凋亡而发挥其抑癌功能
表达产物P53蛋白，转录因子
PTEN
双特异磷酸酶活性
癌基因
细胞癌基因
病毒癌基因
RNA病毒来源于细胞原癌基因（病毒劫持细胞原癌基因）
病毒致癌能力不意味着一定有癌基因
病毒癌基因：小写v，原癌基因：大写C
DNA前病毒
肿瘤治疗重要分子靶点
分子信号转导
化学通讯、
细胞外化学信号的分类：
脂溶性信号
性激素，甲状腺素，维生素A，D
水溶性信号
生长因子，细胞因子
内分泌，自分泌，旁分泌，
受体：识别配体，转换配体信号，细胞内可识别的信号
高度专一性，亲和性，可饱和性，可逆性，特定作用方式
信号转导通路与网络：信号转导分子，信号转导通路，信号转导网络
细胞内信号转导分子
第二信使
核苷酸类
cAMP
ATP → 腺苷酸环化酶AC → cAMP → 磷酸二酯酶PDE → 5‘AMP
蛋白激酶A
R2C2四聚体 → C2二聚体 → PKA（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）
cGMP
GTP → 鸟苷酸环化酶GC → cGMP → 磷酸二酯酶 → 5’GMP
蛋白激酶G
PKG （丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）二聚体
ANP：调节体液稳态及心血管功能
NO：松弛血管平滑肌
脂类衍生物
DAG
二脂酰甘油
DAG+钙离子+磷脂酰丝氨酸（PS） 作用于 PKC(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶) →
IP3
肌醇三磷酸
钙离子通道：内质网与肌质网，钙离子通道打开，细胞内钙离子浓度增加
碳水化合物衍生物
无机分子
钙离子
细胞外液游离钙浓度比细胞内高，细胞内90以上储存在钙库
通过钙调蛋白实现其功能
钙离子 → 钙调蛋白 （CaM） → 钙离子/钙调蛋白依赖蛋白激酶
乙酰胆碱，儿茶酚胺等使钙离子浓度上升
直接激活PKC,AC,cAMP-PDE
NO
NOS一氧化氮合酶
激活鸟苷酸环化酶ADP-核糖转移酶，环氧化酶等传递信号，
NOS的主要调节分子是钙调蛋白
对胞外信号进行转换和放大，激活下游信号分子，
传递方式：浓度变化
传递方式：浓度变化
生成或水解由特定的酶催化
酶
蛋白磷酸酶/蛋白激酶
蛋白质的可逆磷酸化，信号通路开关
蛋白磷酸酶衰减蛋白激酶信号
蛋白激酶
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Ser/Thr）
PKA.PKC.PKG.钙离子-钙调蛋白-PK，MAPK
MAPK级联激活
活化的MAPK进入细胞核，磷酸化TF调节转录
MAPKKK → MAPKK ——MAPK
MAPKK：双功能酶
丝氨酸/苏氨酸模体磷酸化
哺乳动物重要的MAPK亚家族
ERK
级联激活过程： Raf ——MEK——ERK
JNK/SAPK
P38-MAPK
酪氨酸蛋白激酶（Tyr）（PTK）
Src。JAK。某些受体（EGFR）
催化蛋白质分子中酪氨酸残基磷酸化
受体型PTK
生长因子受体
胞外N端
跨膜区α螺旋
胞内催化区（含自身磷酸化位点）
跨膜区α螺旋
胞内催化区（含自身磷酸化位点）
受体二聚化，自身磷酸化
非受体型PTK
作为受体和效应分子之间的信号转导分子
偶联受体发挥作用
调节蛋白
G蛋白
异源三聚体G蛋白
α亚基
具有多个功能位点
受体结合
βγ亚基结合
GTP/GDP结合
下游效应分子相互作用
具有GTP酶活性
β/γ亚基
与α形成复合体定位于质膜内侧，
低分子量G蛋白：小G蛋白
单链结构，具有GTP酶活性，与GTP/GDP结合
最早发现的小G蛋白ras，6个亚家族
调节ras的蛋白因子
GTP酶活性蛋白GAP
鸟苷酸释放蛋白GNRP
鸟苷酸交换因子gef
衔接蛋白
募集和组织信号转导复合物，连接上下游信号转导分子
信号转导复合物
接受和转导信号
结构基础：蛋白质相互作用结构域
蛋白质相互作用结构域
介导信号通路中蛋白质的相互作用
形成复合物的结构基础
支架蛋白
同时结合同一信号通路中的多个信号分子
维持信号转导通路的特异性，增加调控的复杂性和多样性
信号传递的分子机制
构象变化
转位
信号复合物的形式或解聚
浓度及分布变化
受体介导的信号转导通路
细胞膜受体
离子通道受体
神经递质，阳离子阴离子通道，化学信号转变为电信号
G蛋白偶联受体（七跨膜受体）
生物胺；脂类衍生物；肽类激素；
GPCR（G蛋白偶联受体）
糖蛋白，N端外，C端胞内，胞内23环与G蛋白结合，胞外3环与配体结合
配体+受体（GPCR）- 激活- G蛋白 - 激活 - 效应分子 - 第二信使 - 靶分子构象改变 -生物学效应
G蛋白循环
G-GTP——G-GDP之间的转换
霍乱毒素影响G蛋白循环：结合α亚基，GTP酶失活，AC上升，cAMP⬆
G蛋白分类
Gs
AC⬆，钙离子通道打开
α亚基s
Gi
AC⬇，钙离子通道关闭
αi
Gq
PLC（磷脂酶C）↑
αq
α亚基：αt：cGMP-PDE活性⬆ ——cGMP⬇——钠离子通道关闭
G蛋白 -AC-cAMP-PKA
PKA催化亚基使得CREB特定的丝氨酸/苏氨酸磷酸化，形成同源二聚体，结合DNA,激活转录
胰高血糖素
PLC-IP3/DAG-PKC
血管紧张素Ⅱ
钙离子/CaM依赖的蛋白激酶通路
单次跨膜受体
自身具有酶活性的单跨膜受体
PTK
EGFR：ras-MAPK信号通路
自身不具有酶活性的受体
DNA的损伤与修复
损伤：各种体内外因素引起DNA组成和结构的改变
修复
突变
模板功能丧失
DNA损伤
内部因素
复制错误
碱基错配，片段缺失/插入
DNA自身不稳定
脱嘌呤，脱氨基
ROS
活性氧，鸟嘌呤G
外部因素
物理因素
紫外线：
化学因素
自由基
碱基类似物
碱基修饰物
嵌入染料
生物因素
类型
碱基结构破坏
AP位点：无嘌呤嘧啶位点
DNA受热，电离辐射，pH改变
嘧啶二聚体
紫外线照射
脱氨，氧化，碱基取代，丢失，
化学诱导剂：亚硝酸
碱基错配
DNA链断裂
双联
单链
共价交联
链间
链内
DNA蛋白质
突变类型
碱基突变——点突变
转换，颠换
错义突变
无义突变
同义突变
碱基缺失或插入——移码突变
DNA链断裂
损伤修复途径
直接修复
嘧啶二聚体直接修复
光复活酶
烷基化碱基直接修复
烷基化转移酶
单链断裂的直接修复
DNA连接酶
切除修复
碱基切除修复
受损碱基
主要识别损伤的碱基
AP位点，AP内切酶，DNA聚合酶I，DNA连接酶，类似于复制引物的除去
核苷酸切除修复
真核细胞中最重要，原核细胞也有
嘧啶二聚体，DNA螺旋结构的改变
大肠杆菌：uvrABCD
人XP系列蛋白ABC-G
主要识别损伤DNA双螺旋的扭曲，对损伤DNA链的两端进行切割
对核苷酸片段进行切除
核酸内切酶，核酸外切酶，DNA聚合酶，DNA连接酶
错配修复
不符合碱基互补配对
纠正几乎所有的错配
SOS修复
维持存活
精确度差，出错率高
DNA重组技术
目的DNA的分离获取
化学合成法
基因组文库和cDNA文库获取目的基因的DNA
PCR法
其他方法
载体的选择与准备
克隆载体；表达载体；质粒克隆载体；噬菌体DNA载体；其他克隆载体
原核表达载体（大肠杆菌）真核表达载体
原核表达载体（大肠杆菌）真核表达载体
根据目的选择载体：获取目的DNA片段/获取目的DNA表达的蛋白质
目的DNA与载体连接
黏端连接
单一相同黏端连接
子主题
不同黏端连接
定向克隆
其他措施产生黏端
人工接头法
加同聚物尾法
PCR法
平端连接
提高连接酶用量；载体自连；延长连接时间；降低反应温度；增加DNA片段与载体摩尔比
黏平末端连接
定向克隆
重组DNA转入受体扩增
转化
外源DNA直接导入细菌，真菌的过程
感受态细胞，通透性增加，化学诱导法，电穿孔法，
转染
外源DNA质结导入真核细胞，化学方法，物理方法，噬菌体DNA导入受体细菌
感染
病毒颗粒作为外源DNA运载体导入宿主细胞
重组体筛选与鉴定
载体遗传标志进行筛选
抗生素抗性标志
基因的插入失活/插入表达特性
标志补救筛选
噬菌体的包装特性进行筛选
序列特异性筛选
RE酶切法
PCR法
核酸杂交法
质结筛选和鉴定含有目的DNA的克隆
DNA测序法
最准确
亲和筛选
前提是：重组DNA进入宿主细胞后能够表达出编码产物
克隆基因的表达
原核表达体系
条件
含有大肠杆菌适宜的选择标志
具有能够调控转录的强启动子
含适当的翻译控制序列
含有合理设计的多克隆酶切位点，确保目的基因与载体按正确方向进行连接
优势
子主题
劣势
子主题
真核表达体系
优势
劣势
子主题
常用酶
RE;DNA连接酶；DNA聚合酶Ⅰ；Klenow片段；逆转录酶
RE有ⅠⅡⅢ，常用Ⅱ
回文结构；同尾酶；同裂酶（同功异源酶）
基因表达与调控
基本概念
基因表达
转录和翻译的过程，不涉及DNA的复制
时间特异性：按一定顺序发生
空间特异性：多细胞生物个体在特定的生长发育阶段，同一基因在不同组织器官的表达不同
表达方式多样性
基本表达：管家基因，几乎在所有细胞中都有表达
某些基因表达受到诱导和阻遏
功能相关的一组基因受到协调表达
受到调控序列和调节分子的共同调节
调控序列
顺式作用元件
编码基因附近非编码基因，可影响自身基因活性的DNA序列
调节分子
调控基因：远离编码基因，通过其表达产物来对编码基因进行调控
产物称为调节蛋白，可以调控一条列上的结构基因，也可以调节不同链上的结构基因
这些产物称为：反式作用因子
结合在顺式作用元件上进行调控
特异识别DNA序列和顺式作用元件
转录起始，基因表达的基本控制点
原核和真核基因
子主题
子主题
自由主题
对照品
40mg
50mg
称量
添加辅料
溶解
定容
洗涤
滤过
续滤液
定容
测定
60mg
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