23生化-基因工程+分子技术
2022-02-06 16:48:58 0 举报AI智能生成
生化-基因工程+分子技术
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大纲/内容
重组DNA技术
工具酶
①限制性核酸内切酶RE（DNA内部切割3'-5'磷酸二酯键）
保护细菌（存在细菌体内，可限制外源性DNA，保护自身DNA）识别DNA特异序列，裂解磷酸二酯键，切割DNA
分类
REⅠ
REⅡ：精确切割
回纹序列（反向重复序列）→粘性末端
有特异酶解位点，无连接酶活性，其连接指同一限制酶切位点的连接
REⅢ
粘性末端（黏端）
Ⅱ型RE错位切割双链DNA，产生的5'或3'突出末端
回文结构
反向重复序列，指在两条核苷酸链中，从5'→3'方向的核苷酸序列完全一致。大多数RE的识别序列为回文结构
②DNA连接酶
两条DNA链上，有一条链上有缺口→催化形成3’-5'磷酸二酯键
③DNA聚合酶Ⅰ
功能
5’-3'的聚合活性
3’-5'的核酸外切酶活性
5’-3'的核酸外切酶活性
缺口平移法制作高比活性探针
DNA序列分析
类型
大片段Kelown：5’-3'的聚合活性、3’-5'的核酸外切酶活性
3'端标记
逆转录酶→cDNA（互补DNA）→DNA
参与互补DNA的第二条链的合成
小片段：5’-3'的核酸外切酶活性
④逆转录酶
合成cDNA
替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
⑤多聚核苷酸激酶
5’端标记
（ATP）磷酸化标记
标记探针
⑥末端转移酶
＋dC（脱氧胞嘧啶）
3'末端加尾
⑦碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
载体（顺风车）
概念
携带目的外源DNA片段，实现目的DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达
分类
克隆载体（顺风车＋复制）
特点
自主复制功能（最基本）
至少有个选择标志（抗嘌呤霉素标志）
单一酶切位点
常用
质粒
主要存在细菌染色体外的、能自主复制和稳定遗传的DNA分子，环状双链的超螺旋结构，有些质粒可携带抗药性基因，可含克隆位点
噬菌体DNA
其他
柯斯质粒载体
细菌人工染色体载体
酵母菌人工 染色体载体
表达载体
基因工程的基本步骤
分→选→接→转→筛
分：目的基因的获取分离
①化学合成法，已知某基因的核苷酸序列
②基因组DNA文库法
限制性核酸内切酶获取目的基因
③cDNA文库法
找mRNA→cDNA（逆转录酶）
④PCR法
已知目的基因或DNA片段两端序列，合成引物，体外高效扩增
选：载体选择与构建
质粒
自我复制
选择标志
接：目的DNA与载体连接
RE+连接酶
转：重组DNA转入受体细胞
转化：最常用，质粒→大肠杆菌、酵母细胞
转染：质粒→真核（不包括酵母细胞）
感染：质粒→病毒
筛：重组体的筛选与鉴定
借助载体遗传标志筛选
抗生素抗性标记
基因的插入失活/插入表达特性
标志补救方法
噬菌体的包装特性
序列特异性筛选
RE酶切法
PCR法
核算杂交法
DNA测序法
亲和方法
应用
基因诊断
基因治疗
基因的矫正、基因的置换（理想）
基因增补（最主要）
基因的失活、沉默
生物制药
基因组学
基因组
一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整套信息
真核（染色体DNA及线粒体或叶绿体DNA的全部序列）
编码序列
非编码序列
细菌
拟核中DNA序列
质粒
病毒
DNA
RNA
真核：多复制子，单顺反子
原核生物：单复制子，多顺反子
分子生物学技术
分子杂交与印记技术
分子杂交
DNA变性后，如果将不同种类的DNA单链或RNA放在同一溶液中，只要核酸单链之间存在一定碱基配对，可能形成杂化双链
形成D-D，D-R，R-R等
印迹技术
DNA片段变性为单链后，利用NC膜将其转化为固化相分子，放入杂交反应溶液中，溶液中具有互补序列的DNA或RNA单链分子就可以结合到存在于NC膜上的DNA分子上
分类
DNA印记S
RNA印记N
蛋白质印记W
探针技术
带有特殊可检测标记的核酸片段，具有特定序列，能够与待测核酸片段互补结合
检测核酸样品中特定基因
PCR技术
体外目的DNA扩增
基本成分
模板DNA
特异DNA引物（扩增特异DNA序列）
耐热性DNA聚合酶
dNTP及含有Mg2+的缓冲液
基本步骤
①变性：加热至94℃，DNA变性为单链
②退火：下降至事宜温度（一般较Tm低5℃），引物与模板DNA结合
③延伸：升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物合成DNA
主要用途
目的基因的克隆
基因的体外突变
DNA和RNA微量分析
DNA序列测定
基因突变分析
基因文库
一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体
分类
基因组DNA文库：以DNA片段的形式储存着某一生物的全部基因组DNA信息
cDNA文库：包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段贮存着该组织细胞的基因表达信息
生物大分子相互作用研究技术
蛋白质
标签蛋白沉淀
酵母双杂交技术
D-Pr
电泳迁移率变动分析
染色质免疫沉淀技术
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