生化-总结小杂碎
2022-02-06 16:53:31 0 举报AI智能生成
生化-总结小杂碎
作者其他创作
大纲/内容
DNA复制
DNA聚合酶（真原核都有）
DNA复制的生物分子
底物dNTP=dATP、dCTP、dGTP、dTTP
有高能磷酸键
dNMP，连在链上
模版
DNA母链
引物（复制起始处）
由引物酶催化合成的短链RNA分子
提供3‘-OH末端使dNTP依次聚合
DNA聚合酶：依赖DNA的DNA的聚合酶/DDDP
原核生物引物酶
DnaG
解链酶
DnaB
原核生物：聚合酶ⅠⅡⅢ
DNA pol I
作用
复制：校对功能，（大片段）3-5外切（切错配）
复制和修补：填补空隙切除突变片段，大片段5-3聚合➕小片段5-3外切酶（切突变）
大片段（Klenow片段）
DNA聚合酶活性➕3-5外切酶活性
合成DNA和进行分子生物学研究常用工具酶
小片段
5-3外切酶（独有）活性，将引物RNA和突变DNA片段切掉
DNA pol II
应急状态的损伤修复
5-3聚合，3-5外切
DNA pol III
复制延长真正起催化作用的酶
5-3聚合，3-5外切
修复以3为主要
真核生物：αβγδε
α引物酶
催化RNA链合成（引物酶酶活性），辨认DNA新链合成的起始点
β
复制保真度低，参与应急DNA修复
γ
线粒体DNA复制
δ
前导链与后随链合成，错配修复
复制延长中，起主要催化作用
解旋酶活性
ε填补缺口
错配修复
复制中校对修复、填补缺口
催化合成随从连
DNA复制的保真性
DNA pol的碱基选择➕校对功能=复制的保真性
三种机制实现保真性
1⃣️碱基互补配对原则
2⃣️pol在复制延长中对碱基的选择功能
3⃣️校对功能
原核：pol I
真核：pol δ和pol ε 的3-5外切酶活性
过程
原核生物（大肠埃希菌）
复制起始
相关蛋白
DnaA，辨认起始点
拓扑酶
理顺DNA链，通过切断旋转再连接作用，正超螺旋➡️负超螺旋
拓扑酶I：切断一股，使解链过程不敢打结，适当时候还可封口，使DNA松弛
拓扑酶II：
无ATP时，切断正超螺旋的DNA双链，使超螺旋松弛
有ATP时，连接断段，使松弛恢复负超螺旋
DnaB（解旋酶）：解开双链
DnaC：运送和协同DnaB
SSB（单链结合蛋白）：稳定已解开的单链
DNA的解链
DnaA：辨认起始点并结合AT区
有固定起始点oric（单个）
识别区：上游串联重复序列
富含AT区：下游反复重复序列碱基以AT为主，以解链
多种蛋白质参与
Dna A，B，C，SSB
需DNA拓扑异构酶
引物合成和引发体形成
引发体：DnaB，C，G，和DNA的复制起始区域共同形成的复合结构
引发体在DNA链上移动，需ATP
引物酶催化生成RNA引物
DNApol不能催化两个游离dNTP形成磷酸二酯键，只能催化核酸片段的3‘-OH末端与dNTP的聚合，故引物只能是RNA
复制延长
引发体：DnaB，DnaC，引物酶DnaG，DNA特定起始点
Dna G（引物酶）：催化RNA引物的形成
DNApol III，本质是磷酸二酯键的不断合成
冈崎片段
原因：随从链的合成方向与解链方向相反
片段特点：原核（1000-2000核苷酸残基），合成方向5-3，每个片段5‘段均有RNA引物
复制终止
原核生物是环状DNA
单起点双向复制
起：oriC；终：ter
即冈崎片段的处理
去除引物：RNA水解酶
填补空隙：DNApol I
连接切口：DNA连接酶（耗能）
子主题 4
真核生物（酵母菌，人）
复制起始
起始点：多个
复制单位：多个，复制速度慢
复制方向：双向
参与起始的物质：DNApol a，δ、拓扑酶、复制因子RF、PCNA（增值细胞核抗原，在复制和延长中起关键作用）
复制延长
发生DNApola/δ转换
就催化速率，比原核生物合成速度慢
真核多复制子复制，整体速度不慢
DNA合成后立即组装成核小体
三级结构
原核生物三级超螺旋
复制终止
端粒
概念：真核染色体线性DNA分子末端结构
维持染色体稳定性➕DNA复制完整性
特点：富含T、G短序列多次重复
端粒酶
RNA➕Pr组成。特殊逆转录酶，参与端粒合成
包括：RNA➕协同蛋白1➕逆转录酶
提供RNA模版➕催化逆转录：以自身RNA为模版合成互补链
通过一种爬行模型机制维持染色体的完整，不依赖模版的复制（防止染色体线性RNA分子末端缩短）
DNA损伤（突变）与修复
环境：嘌呤最容易脱落
DNA损伤
紫外线：形成嘧啶二聚体共价键（同一条链）
光修复
类型
碱基错配（点突变）：
碱基的置换（可导致氨基酸置换）
转换：嘌呤与嘌呤，嘧啶与嘧啶
颠换：嘌呤与嘧啶
举例：镰刀细胞贫血（CTC谷氨酸→CAC缬氨酸），错义突变
由于密码子兼并性
无义突变→突变为终止密码子→肽链变短
错义突变→氨基酸突变、镰刀细胞贫血
同义突变→简并性
移码突变（非3n）读码框移
碱基缺失
碱基插入
重组、重排（较大片段的交换）
急性早幼粒（15,17）
慢粒（9,22）
地中海贫血
修复
sos修复：紧急修复（精确差、错误高、校对差）
方式
直接修复
嘧啶二聚体
光修复：紫外线嘧啶二聚体
切除修复（最常见）
碱基切除修复
相关酶：DNA糖基化酶，AP核酸内切酶，DNApol I，DNA连接酶
过程
1⃣️识别水解，无碱基的AP位点
2⃣️切除
3⃣️补
pol I
4⃣️连接
核苷酸切除修复（单链）
相关疾病：着色性干皮病XP，人毛发硫营养不良症
重组修复（双链）
跨越损伤修复
重组跨越损伤修复
合成跨越损伤修复
DNA双链发生大片段，高频率损伤时，细胞可以紧急启动应急修复系统（SOS修复）
常见病：遗传性非息肉性结肠癌，遗传性乳腺癌，着色性干皮症导致的皮肤癌，黑色素瘤
发病机制-DNA修复系统缺陷
遗传密码
概念：在mRNA的开放阅读框架区，每三个相邻的核苷酸为一组，编码一种氨基酸，这样串联排列的三个核苷酸为密码子；与其相对应的tRNA上的为反密码子
AUG（起始信号→甲硫氨酸）
UAA、UAG、UGA（终止密码子）
特点
方向性
5-3
连续性
mRNA的密码子之间没有间隔核苷酸，与移码突变有关
简并性（同义密码子）
保持生物学稳定，降低基因突变的生物学效应
64个密码子有61个编码氨基酸，氨基酸有20种➡️某些氨基酸可由多个密码子编码
通用性
细菌到人共用一套遗传密码
摆动性
密码子翻译通过与tRNA的反密码子配对反应而实现，不严格遵循碱基互补配对原则
I→A、C、U
第三位可以不同
分支主题
维持生物表型稳定
1⃣️羟脯氨酸，羟赖氨酸无密码子2⃣️甲硫氨酸AUG，色氨酸UGG均只有一个密码子3⃣️假设只有一个密码，其密码子与起始密码相同的氨基酸—蛋氨酸AUG
转录
原核生物
RNA聚合酶（1种）
RNA聚合酶α2 β β‘ σ（全酶），具有合成mRNA，tRNA，rRNA功能，无校对功能，缺乏3-5外切酶活性
RNA聚合酶α2 β β‘ （核心酶），参与转录全过程
RNA聚合酶σ：辨认转录起始点，结合启动子
启动子-35区TTGACA
滑到-10区TATAAT
RNA聚合酶α ：决定那些基因被转录（转录基因型），与转录频率有关，只参与启动！不参与延长
RNA聚合酶 β：与底物NTP结合，，形成磷酸二酯键，起催化作用
eg.利福平或利福霉素专一性结合β亚基，抑制结核杆菌转录
延长
RNA聚合酶β ’：解开螺旋
启动转录
DNA链上
操纵子：调控序列+多个编码区
乳糖操纵子
启动子：RNA聚合酶和启动子结合
TTGACA
-35
TATAAT：（pribrow盒）
-10
-10区（结合部位）
TATAAT（Pribnow盒）
易解链作为转录模板！，具有高度保守和一致性，β”结合模板的部位
-35区（识别部位）
TTGACA
RNApolσ因子识别序列
转录过程
转录起始
①RNApol识别并结合启动子，形成闭合转录复合体，此时DNA仍保持双链结构。（σ辨认转录起始点-35区，并向10区移动）
②DNA双链打开，闭合转录复合体→开放转录复合体
③第一个磷酸二酯键形成（不需引物）
转录延长
①σ脱落，核心酶参与该过程
②转录产物从5-3延长，新的核苷酸加到3-OH
③转录翻译同时进行，形成转录空泡）羽毛状图形
转录终止
①依赖ρ因子
ρ识别并结合polyC→RNApol构象变化并停顿，ρ中解螺旋酶活性使DNA/RNA杂化双链拆离→转录终止
②非依赖ρ因子
识别RNA的茎环结构和3-端连续的U→转录终止
电镜下羽毛状结构，原核生物
真核生物
RNA聚合酶
Ⅰ：核仁，45s-rRNA→28S、5.8S，18SrRNA
不敏感
Ⅱ：核浆，hnRNA→mRNA、micRNA
极敏感
lnc，pi
Ⅲ：核浆，tRNA、5s-rRNA、snRNA
snRNA：剪接体
敏感
RNApol
转录过程
转录起始
顺式作用原件（转录起始点上游的特异DNA序列）
启动子-25（TATA盒（Hogmers盒），RNA聚合酶结合到DNA的启动子上启动转录）
启动子上游元件（GC盒和CAAT盒）
增强子
转录因子TF/反式作用因子
TFIID结合TATA盒
TFIIA，TFIIB，TFIIE（解螺旋酶）TFIIF，TFIIH（解螺旋酶，催化CTD磷酸化）
TFII最重要
TFII
基本转录因子，参与真核生物mRNA的转录，真核生物进化中高度保守
TFIID 最重要
结合TATA
上游因子
与启动子上游元件结合的蛋白质
Sp1与GC盒结合
C/EBP与CAAT盒结合
PIC（转录起始前复合物）
TFIID，B，A，F，E，H，-RNApolII
转录延长
转录翻译不同时进行
转录终止
转录终止和加尾修饰同时进行
RNA合成后的加工修饰
细胞核中加工
mRNA
5'-加帽
7-甲基鸟嘌呤
m7GTP
使mRNA免遭核酸酶的攻击
3'-加尾
多聚腺苷酸尾poly（A）
维持mRNA作为翻译模板的活性以及增加mRNA本身稳定性的因素
前体mRNA的剪接
去除内含子，连接外显子
内含子：被转录但不被翻译。hnRNA中被剪接去除的核酸序列，不出现在相应mRNA中
外显子：被转录也被翻译。保留在mRNA中的片段
剪接体：内含子剪接场所，由5种核小RNA（snRNA）➕50种Pr
核小核糖体蛋白颗粒（snRNA）👉参与形成小分子核糖核蛋白体
mRNA编辑：对基因的编码序列进行转录后加工
参与切割mRNA：miRNA➕siRNA
rRNA
45SrRNA→18S，5.8S，28S
①5'端：16个核苷酸序列由RNaseP切除
②3端：2个U被RNaseD切除，再加上CCA-OH
③茎环结构：经化学修饰为稀有碱基
④切除内含子
tRNA（含稀有碱基最多）
①切除5'前导序列及内含子
②添加CCA-OH的3'末端
③生成稀有碱基
④化学修饰
甲基化反应
脱氨基反应
核苷酸内转位反应
还原反应
蛋白质的翻译后加工修饰
部位:内质网、高尔基体等
分子伴侣：促进蛋白质正确折叠
触发因子新生链化合物
热激蛋白=热休克蛋白Hcp
伴侣蛋白=伴侣素
信号肽
氨基酸残基→化学修饰（泛素化（×）加帽子（×））
空间结构修饰
翻译后修饰
肽链折叠（需要分子伴侣）
热激蛋白（热休克蛋白，HSP）
HSP70
HSP40
GrpE
伴侣蛋白
为非自发性折叠肽链提供能折叠形成天然空间构象的微环境
肽键水解（生成活性蛋白质或功能肽）
新生多肽链的有限水解是一种最常见的翻译后加工形式
①末端被水解加工
N端水解
经脱甲酰基酶切除N-甲酰基而保留甲硫氨酸
被氨基肽酶水解而切除N-甲酰甲硫氨酸
C端水解
②肽链中肽键被水解产生多种功能肽
胰岛素原→胰岛素
蛋白酶原→蛋白酶
化学修饰（氨基酸残基）
均为酶促反应
常见分类
磷酸化（丝，苏，酪氨酸）
糖基化
乙酰化
脯氨酸 赖氨酸 羟化
靶向输送
亚基聚合和辅基连接
非共价键亚基聚合为具有四级结构的蛋白质→针对四级结构的蛋白质
辅基连接后形成完整蛋白质→针对结合蛋白质
二硫键形成
1⃣️蛋白质生物合成过程
合成过程
起始（imitation）IF
原核生物
70S核蛋白体
①大小亚基分离：IF-3，IF-1与小亚基结合，促使大小亚基分离
②小亚基位于mRNA：通过RNA-RNA，RNA-蛋白质相互作用，小亚基定位于mRNA上的起始AUG
需要SD序列
③fMet-tRNA（fMet）与小亚基P位结合
④核糖体大亚基结合形成起始复合物：结合于IF-2的GTP被水解，促使3种IF释放，形成由完整核糖体，mRNA，fMet-tRNA（fMet）组成的翻译起始复合物。
真核生物
80S核蛋白体参与合成
①大小亚基分离：eIF-2B，eIF-3与小亚基结合；在eIF-6参与下大小亚基分离
②Met-tRNAi（Met）定位结合于小亚基p位：eIF-2
③小亚基定位于mRNA
④大亚基结合：eIF-5
延长(elongation)EF。❌ATP
进位/注册：结合于A位
原核
EF-TU：具有GTP酶活性
EF-Ts：调节亚基
真核
eEF-1α：促进进位，结合分解GTP
eEF-1β：调节亚基
成肽
转肽酶催化形成肽键
转位
核糖体沿着mRNA的移位，EF-G（原核）/eEF-2（真核）促进tRNA卸载与释放
终止（release）RF
大小亚基拆开，终止密码的辨认，mRNA从核蛋白体中分离，新生肽链脱落，tRNA及终止子释放
真核
3种RF
RF1识别UAA或者UAG
RF2识别UAA或UGA
RF3与GTP结合并使其水解，协助RF1与RF2与核糖体结合
真核
1种RF
eRF可识别所有终止密码子
原核表达调控
操纵子是其转录调控基本单位
定义
原核基因按照功能相关性成簇的串联，密集在染色体上，共同组成一个转录单位，即为操纵子
操纵子
结构基因（下游）
数个功能上相关的基因串联排列，共同构成编码区
调控序列（上游）
启动子
是RNA聚合酶和各种调控蛋白作用的部位，是决定基因表达效率的关键原件
-10区的TATAAT序列（Pribnow盒）；-35TTGACA序列
操纵元件
一段能被特异的阻遏蛋白识别和结合的DNA序列
阻遏蛋白➕操纵序列会阻碍RNA聚合酶与启动子结合或使RNA聚合酶不能沿DNA移动，阻遏转录→负性调节
调节基因
编码能够与操纵序列结合的调控蛋白
①特异因子：决定RNA聚合酶对启动序列的特异性识别和结合能力
②阻遏蛋白：识别并结合操作序列，抑制基因转录→负性调节
③激活蛋白
结合启动子邻近的DNA序列，提高RNA聚合酶与启动序列的结合能力，增强其活性→正性调节
举例🌰🌰分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）
乳糖操纵子（Lac）是诱导型调控
结构
三个结构基因
Z:β半乳糖酐酶
Y：通透酶
A：乙酰转移酶
三个调控序列
CAP结合位点：
CAP激活蛋白（可诱导）
葡萄糖↓→cAMP↑→CAP→启动
P：启动序列（promote）
RNA聚合酶
调节基因I
有独立启动子PI，编码阻遏蛋白，阻遏蛋白与O序列结合
0 :操作序列（Operate）：阻遏蛋白结合位点
调节
阻遏蛋白的复性调节
乳糖不存在，I基因表达阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录启动
乳糖存在，操纵子被诱导
真正诱导剂是半乳糖
乳糖→β半乳糖酐酶、透酶→半乳糖→移开在O上的阻遏蛋白→启动
协调调节
Lac阻遏蛋白复性调节与CAP正性调节相协调
过程
阻遏蛋白（负性调节）、CAP(正性调节)
CAP的正性调节
CAP内有DNA结合区及cAMP（结合活化CAP）结合位点
①无葡萄糖→cAMP↑→cAMP与CAP结合→RNA转录活性↑
②有葡萄糖→cAMP↓→cAMP与CAP结合受阻→RNA转录活性↓
色氨酸操纵子：阻遏型调控
无色氨酸时，阻遏蛋白与O序列结合受阻→开放→结构基因表达
分支主题
色氨酸多时，色氨酸+阻遏蛋白与O序列结合→关闭→停止表达
弱化和衰减作用
让已经起始的转录停止，载有色氨酸的T-RNA增多
转录终止阶段的调控机制
转录终止机制
依赖ρ因子
不依赖ρ因子（识别RNA茎环结构和3'端连续的U）
终止调节方式
衰减
抗终止
真核表达调控
真原核基因特点
①真核基因组＞原核
②
原核大部分为编码基因，重复序列少；
真核10%编码序列，含大量重复序列
③
原核：基因序列连续，无内含子
真核：编码基因不连续，转录后需去除内含子，连接外显子
④
原核：多顺反子mRNA（数个结构基因常串联排列构成一个转录单位，转录生成的一条mRNA可编码几种功能相关的蛋白质）
真核：单顺反子mRNA（一个mRNA只编码一种蛋白质）
⑤
真核DNA构成染色质，结构复杂
⑥
真核遗传信息→核DNA和线粒体DNA
转录起始是真核生物基因表达调控的关键
顺式作用原件
是指转录起始的关键调节部位
可影响自身基因表达活性的DNA序列
非编码序列
并非都位于转录起始点上游
包括
启动子
包括至少一个转录起始点➕一个以上的功能组件
TATA盒
TATAAAA，控制转录起始的准确性及频率，TFIID结合位点，能与RNA聚合酶结合
GC盒（GGGCGG，结合转录因子SP1）和CAAT盒（GCCAAT）
增强子
转录因子结合DNA的核心序列➕提高转录效率
特点：
在基因上游、下游或远距离起调节作用
需要启动子才能发挥作用
与方向无关
与远近距离无关
沉默子
复性调控；抑制基因转录
转录因子是转录调控的关键分子
对于真核，转录调节蛋白＝转录调节因子＝转录因子（TF）＝反式作用因子
结构特点
大多数TF是DNA结合蛋白
至少两个结构域
DNA结合域
锌指结构
碱性螺旋-环-螺旋膜体结构
碱性亮氨酸拉链膜体
转录激活域
分支主题
第二信使（→激活蛋白激酶）
cAMP
（环磷酸腺苷）、
cGMP
（环磷酸鸟苷）
DG
（二酰甘油）、
IP3
（三磷酸肌醇）
PIP3
Ca2+、花生四希酸AA
神经酰胺
NO
CO
cADPR
G蛋白
霍乱毒素可以让GTP酶活性丧失，G蛋白保持活化
涉及G蛋白信号通路有
PKA
PKC
CaM
Ras蛋白，有GTP活性
基因工程（基因重组，分子克隆，DNA克隆）基因诊断，基因治疗
重组DNA技术
工具酶
①限制性核酸内切酶RE（DNA内部切割3'-5'磷酸二酯键）
保护细菌（存在细菌体内，可限制外源性DNA，保护自身DNA）识别DNA特异序列，裂解磷酸二酯键，切割DNA
分类
REⅠ
REⅡ：精确切割
回纹序列（反向重复序列）→粘性末端
有特异酶解位点，无连接酶活性，其连接指同一限制酶切位点的连接
REⅢ
粘性末端（黏端）
Ⅱ型RE错位切割双链DNA，产生的5'或3'突出末端
回文结构
反向重复序列，指在两条核苷酸链中，从5'→3'方向的核苷酸序列完全一致。大多数RE的识别序列为回文结构
②DNA连接酶
两条DNA链上，有一条链上有缺口→催化形成3’-5'磷酸二酯键
③DNA聚合酶Ⅰ
功能
5’-3'的聚合活性
3’-5'的核酸外切酶活性
5’-3'的核酸外切酶活性
缺口平移法制作高比活性探针
DNA序列分析
类型
大片段Kelown：5’-3'的聚合活性、3’-5'的核酸外切酶活性
3'端标记
逆转录酶→cDNA（互补DNA）→DNA
参与互补DNA的第二条链的合成
小片段：5’-3'的核酸外切酶活性
④逆转录酶
合成cDNA
替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
⑤多聚核苷酸激酶
5’端标记
（ATP）磷酸化标记
标记探针
⑥末端转移酶
＋dC（脱氧胞嘧啶）
3'末端加尾
⑦碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
载体（顺风车）
概念
携带目的外源DNA片段，实现目的DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达
分类
克隆载体（顺风车＋复制）
特点
自主复制功能（最基本）
至少有个选择标志（抗嘌呤霉素标志）
单一酶切位点
常用
质粒
主要存在细菌染色体外的、能自主复制和稳定遗传的DNA分子，环状双链的超螺旋结构，有些质粒可携带抗药性基因，可含克隆位点
噬菌体DNA
其他
柯斯质粒载体
细菌人工染色体载体
酵母菌人工 染色体载体
表达载体
基因工程的基本步骤
分→选→接→转→筛
分：目的基因的获取分离
①化学合成法，已知某基因的核苷酸序列
②基因组DNA文库法
限制性核酸内切酶获取目的基因
③cDNA文库法
找mRNA→cDNA（逆转录酶）
④PCR法
已知目的基因或DNA片段两端序列，合成引物，体外高效扩增
选：载体选择与构建
质粒
自我复制
选择标志
接：目的DNA与载体连接
RE+连接酶
转：重组DNA转入受体细胞
转化：最常用，质粒→大肠杆菌、酵母细胞
转染：质粒→真核（不包括酵母细胞）
感染：质粒→病毒
筛：重组体的筛选与鉴定
借助载体遗传标志筛选
抗生素抗性标记
基因的插入失活/插入表达特性
标志补救方法
噬菌体的包装特性
序列特异性筛选
RE酶切法
PCR法
核算杂交法
DNA测序法
亲和方法
应用
基因诊断
基因治疗
基因的矫正、基因的置换（理想）
基因增补（最主要）
基因的失活、沉默
生物制药
基因组学
基因组
一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整套信息
真核（染色体DNA及线粒体或叶绿体DNA的全部序列）
编码序列
非编码序列
细菌
拟核中DNA序列
质粒
病毒
DNA
RNA
真核：多复制子，单顺反子
原核生物：单复制子，多顺反子
分子生物学技术
分子杂交与印记技术
分子杂交
DNA变性后，如果将不同种类的DNA单链或RNA放在同一溶液中，只要核酸单链之间存在一定碱基配对，可能形成杂化双链
形成D-D，D-R，R-R等
印迹技术
DNA片段变性为单链后，利用NC膜将其转化为固化相分子，放入杂交反应溶液中，溶液中具有互补序列的DNA或RNA单链分子就可以结合到存在于NC膜上的DNA分子上
分类
DNA印记S
RNA印记N
蛋白质印记W
探针技术
带有特殊可检测标记的核酸片段，具有特定序列，能够与待测核酸片段互补结合
检测核酸样品中特定基因
PCR技术
体外目的DNA扩增
基本成分
模板DNA
特异DNA引物（扩增特异DNA序列）
耐热性DNA聚合酶
dNTP及含有Mg2+的缓冲液
基本步骤
①变性：加热至94℃，DNA变性为单链
②退火：下降至事宜温度（一般较Tm低5℃），引物与模板DNA结合
③延伸：升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物合成DNA
主要用途
目的基因的克隆
基因的体外突变
DNA和RNA微量分析
DNA序列测定
基因突变分析
基因文库
一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体
分类
基因组DNA文库：以DNA片段的形式储存着某一生物的全部基因组DNA信息
cDNA文库：包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段贮存着该组织细胞的基因表达信息
生物大分子相互作用研究技术
蛋白质-蛋白质
标签蛋白沉淀
谷胱甘肽转移酶
酵母双杂交技术
免疫共沉淀
DNA-蛋白质
电泳迁移率变动分析
一结合速度就慢
染色质免疫沉淀技术
看是否有DNA
癌基因、抑癌基因（重要）
原癌基因
概念
又称癌基因、细胞癌基因，指存在于正常细胞基因组中，其编码产物通常作为正调控信号，促进细胞增值生长
癌基因的突变或表达异常是细胞恶性转化（癌变）的重要原因
存在病毒中的被称为病毒癌基因
感染宿主细胞
广义癌基因指
能编码生长因子➕生长因子受体➕细胞内信号转导分子➕与生长有关的转录调节因子的基因
特点
基因序列高度保守
广泛分布在生物界
对正常细胞发育、繁殖、生长和分化起着精确调控作用
某些因素下突变
原癌基因的激活
①获得启动子、增强子
②染色体易位
③基因扩增
④点突变
分支主题
生长因子受体
福尔摩斯杀了他的前女友
raf-丝苏
分支主题
分支主题
抑癌基因（p）
概念
又称肿瘤抑制基因，抗癌基因，是一类抑制细胞异常生长和增值而阻遏恶变的基因
癌基因与肿瘤抑制基因相互制约，维持细胞增值正负调节信号的相对稳定，促进细胞分化
常见
RB：最早发现
失活与视网膜母细胞瘤+骨肉瘤+小细胞性肺癌有关
宫颈癌HPV
产物：RB蛋白；去磷酸化（或低磷酸化）形式为活化型，能促进细胞分化，抑制细胞增值
将基因导入RB细胞或成骨肉瘤细胞，恶性细胞生长生长受到抑制
TP53
突变最广泛的肿瘤抑制基因➕与人类肿瘤相关性最高的基因
产物：P53蛋白；基因卫士，野生型P53蛋白维持细胞正常增长，抑制恶性增值
细胞损伤时，P53的主要作用是使细胞停在G1期，启动细胞凋亡程序
突变型P53为癌基因；野生型为抑癌基因
PTEN
第一个具有双特异性磷酸酶活性的肿瘤抑制基因
其编码产物PTEN可催化PIP3→PIP2（PIP2是胰岛素、表皮生长因子等细胞生长因子的信号转导分子，对细胞生长起复性调节）
P16
黑色素瘤
APC（结肠癌，胃癌）
DCC（结肠癌）
机制
不能表达或产物失去活性时，细胞会异常生长和增值，最终恶变
反之，若导入或激活它则可抑制细胞恶性表型
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原癌基因的产物
生长因子类
SIS→PDGF-2（FDGF血小板源生长因子）
INF-2→FGF同类物，促进细胞增值
①多数为多肽类物质②具有调节细胞生长和分化的作用③受体多位于靶细胞膜④旁分泌自分泌
蛋白酪氨酸激酶类生长因子受体
EGFR→EGF受体，促进细胞生殖
HER-2（又称erb-B2）→EGF受体类似物，促进细胞增值
FMS、KIT→M-CSF受体、SCF受体，促增值
酪氨酸膜结合：SRC、ABL
细胞内酪氨酸激酶：TRK
丝氨酸、苏氨酸激酶：RAF（MAPKKK）（染发）
ras-GTP→RAF
GTP结合蛋白：ras
核内转录因子：MYC、FOS、JUN（母夜叉快速将军队转移到梁山上）
生长因子
TnT、SIS、EGF、PDEF
内分泌、旁分泌、自分泌
概念
一类由细胞分泌的，类似于激素的信号分子，多数为肽类（含蛋白质）物质
具有调节细胞生长与分化的作用
机制
受体介导的细胞信号转导
作用位点大多数在细胞膜，表达产物将信息传递到细胞内部，调节生长与分化
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