植物细胞工程

胚、胚珠和子房以及试管受精克服远缘杂交不育性

花药、花粉培养育成单倍体植株

原生质体融合产生体细胞杂种

脱毒植物

核质关系

植物激素的作用机理

有性繁殖植物遗传分离群体的构建

基因定位

单克隆抗体治疗癌症

用木质素制作地膜

培养可转化DDT的细菌，净化土壤

玻璃、塑料和其他实验器皿洗涤与贮存室

培养基准备和灭菌室

无菌操作室

培养室

显微操作和观察室

人工气候室或温室

酸度计、微波炉、PCR仪、纯水系统、摇床、移液器、酶标仪、水浴锅、制冰机

满足客户要求、设计合理、功能齐全、保障安全、应用方便、经济实用

所有培养器皿、培养基、外植体、培养环境、用于培养的工具、操作过程、操作者本身、超净工作台

物理方法

化学方法

操作过程中反复使用的工具，通常用95%乙醇火焰灭菌

清洗外植体；超净工作台内70%乙醇30s；无菌水冲洗3次；0.1%氯化汞5-8min或更长；无菌水冲洗5-6次；超净工作台内接种；培养室内暗配养或光照培养

某些生长素，如GA、玉米素、ABA、尿素和某些维生素不耐热，不应该通过高压蒸汽灭菌

无菌操作室和培养室内除经常保持清洁外，需定期进行熏蒸灭菌。常用甲醛进行熏蒸

培养架和地面可用1%-2%来苏儿水（煤酚皂溶液）擦拭

无菌操作前先打开紫外灯照射对室内进行灭菌

血球计数板构造

了解培养细胞的数目和生物量的变化

将15mL细胞悬浮液置于刻度离心管中，然后再2000xg的离心力下离心5min。记录离心管内沉淀的细胞体积，然后计算出每毫升细胞悬浮液中细胞体积（mL），用来表示细胞的生物量

鲜重法：在植物悬浮培养细胞继代培养时，取一定体积的悬浮细胞培养物，置于称重的离心管内，离心收集后，称重，得到细胞的鲜重，计算出每毫升悬浮液中细胞的鲜重。每个2天取样一次，共7次，每个样品重复3次，整个实验过程中不再往培养瓶中加入新鲜培养液。以鲜重为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制鲜重增长曲线

干重法：在称量鲜重之后，在60摄氏度的烘箱内将细胞烘干至恒重，称量其干重，计算出每毫升悬浮液中细胞的干重。以干重为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞干重生长曲线

酚藏花红染色法

荧光双醋酸酯（FDA）染色

台盼蓝染色法

四唑盐（MTT）比色法

含盐量较大的培养基

硝酸钾含量较高的培养基

含盐量中等的培养基

低盐浓度的培养基

前两类培养基比较适合愈伤组织诱导和细胞培养，但选用哪一类培养基，应依植物种类、基因型和外植体等而定；诱导愈伤组织常用的培养基为MS和B5。高盐浓度的培养基可能对培养过程中愈伤组织数量及鲜重的增加有利。

后两类培养基有利于根的形成

作用

促进组织和细胞培养中器官分化和胚状体的形成应注意

糖的浓度和种类

有机添加物

无机营养物质

大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S

微量元素:Fe、Cu、Mn、Co、Mo、B、I、Zn、Cl等

注意：铁盐，在配培养基时单独

各种培养基中无机N都以两种形式供应：硝态氮和铵态氮

含氮物质

碳源

种类

注意

琼脂并不是培养基必要的成分，对培养物起到支持作用；使用浓度0.8-1%，若浓度过高，培养基会变硬，营养物不易扩散到组织中

固体培养基

液体培养基

通常为5.0-6.0，pH<5.0培养基不能很好胶化；pH>6.0培养基硬度大。目前多采用pH=5.8

植物细胞（体细胞或生殖细胞）均含有该物种全部的遗传信息，每个植物细胞均具有发育成完整植物体的潜力

以植物的体细胞（如根、茎、叶等）为培养材料，诱导形成完整植物体。

以植物的生殖细胞（如小孢子和大孢子细胞）为培养材料，诱导形成完整小植物体

培养去壁的原生质体，使原生质体发育成为完整植物体。

利用诱导剂，促使两个不同种的原生质体相互融合后进行培养，使其发育为杂种植物体。

将遗传信息（基因）利用不同基因载体（Ti或Ri质粒）导入植物细胞，通过离体培养使之再生成具有新性状的植物体。

细胞分化是多细胞生物体形态发生的基础

细胞分化在植物形态建成中是一个核心问题，没有细胞分化就没有形态建成

植物发育和细胞分裂、生长、分化有时间和空间上的必然联系

器官分化途径

胚状体发生途径

培养基成分、pH、温度、光照、基因型、激素

DNA、RNA和蛋白质的合成

氮同化和氨基酸代谢

碳水化合物的代谢与利用

内源激素的平衡

选用长度0.5cm左右的茎尖为外植体

将材料用流动的自来水冲洗净，再用蒸馏水冲洗，用无菌纱布或吸水纸吸干水分，在用消毒刀片切成小块；在无菌环境中将材料放入70%乙醇中浸泡30~60s后，用无菌水冲洗2~3次；将材料移入漂白粉饱和液或0.1%氯化汞溶液中消毒6~12min；取出后用无菌水冲洗3~6次

在无菌环境下，将外植体接种在适宜培养基上，封口培养；培养环境：温度25摄氏度左右，光照12h/d

与胚龄密切相关

未受精胚珠培养

受精胚珠培养

胚珠剥离时期的选择、胎座的有无、接种前的预处理、培养基、培养条件

基因型、外植体的发育程度、接种前的预处理、花被组织

基因型、胚乳的发生类型和发育程度、胚的参与、培养基和培养条件

在无菌条件下，将表面消毒的未授粉子房切开，取出胚珠，接种在适宜的培养基上进行培养；在试管内散播花粉；花粉萌发后，花粉管伸入胚珠内受精；受精后的胚珠进一步发育形成种子，种子能在培养基上发芽长成植株

培养基

花粉的灭菌

鉴别受精的标记性状

母体组织的影响

改变原来的分化方式和代谢方式，合成代谢加强，合成大量蛋白质和核酸物质为细胞的分裂和增殖奠定基础

外植体外层细胞开始分裂，细胞脱分化，愈伤组织结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透明

愈伤组织表层细胞分裂逐渐停止，而转向其内部的局部地区，并改变分裂面的方向，出现瘤状结构外表，愈伤组织中可以发现维管组织，但不形成维管系统

疏松易碎的愈伤组织、坚硬/木质化的愈伤组织、水渍粘稠的愈伤组织

愈伤组织无任何形态结构，新鲜愈伤组织颜色为奶黄色或白色有光泽，少数也有淡绿色或绿色或红色；老化的愈伤组织则转变为黄色至褐色

愈伤组织遗传上的不稳定性因基因型、外植体、培养基成分和培养时间而异

同基因型的同一种外植体在不同培养基上会产生不同的变异

组织培养中涉及到遗传变异主要是细胞核组成的改变，变异是不可逆的，这种遗传上的改变可以是染色体畸变，细胞核破碎，或者是由于细胞内复制引起的多倍性以及分子水平上的改变形式

培养基成分，特别是外源激素的成分与变异的产生密切相关

影响愈伤组织诱导率；影响愈伤组织芽分化率、植株再生率；影响愈伤组织的生物量

外植体的类型影响愈伤组织诱导率、形态及植株再生；外植体年龄影响愈伤组织器官发生的能力

含盐量较大的培养基、硝酸钾含量较高的培养基、含盐量中等的培养基、低盐浓度的培养基

生长调节物质

有机成分

无机营养成分

培养基pH

活性炭等一些惰性物质

光质

光强

影响愈伤组织起始时间、诱导率和形态；影响愈伤组织形态和质地；影响愈伤组织形态建成

为芽形成提供物质和能量

生长在同一种培养基上的处于分化的愈伤组织和未分化的愈伤组织间内源激素的水平明显不同

细胞激动素类化合物在器官发生过程中可能作用于基因表达的翻译阶段

目前已公认与分化有关的标志酶为过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶、甲基转移酶

在外植体上已存在有根原基，即根原基不是重新发生的，常与取材部位有关

在外植体上重新分化根原基而发生不定根，如从茎尖、茎段分化不定根

从愈伤组织分化不定根

在形成根原基的部位细胞里有大量的淀粉积累，淀粉酶活性提高为不定根形成提供物质和能量

水杨酸和乙烯利诱导产生的色素增加了12-13倍

定义

原理

体细胞胚发生途径有直接途径和间接途径，但无论哪一种发生途径，绝大多数研究报道认为体细胞胚胎起源于单细胞，从多种植物中都观察到单个胚性细胞，有不均等分裂的二细胞原胚和均等分裂的二细胞原胚、多细胞原胚、球形胚直到成熟胚。也有研究认为起源于多细胞

基因型、外植体、培养基、光照

陆地棉花体细胞胚同步化的诱导继代培养在垫滤纸固体培养基上

物种、基因型、外植体、培养基、诱导方法

一般来说，胚胎一旦被分化出来或甚至完成诱导之后转移到基本培养基上即可发育成熟，并形成小植株

一种是体细胞胚不完全萌发，即只有芽而无根或只有根而无芽

另一种是体细胞胚早熟萌发，即体细胞胚还未表现出完整的胚结构之前就已萌发，萌发时盾片膨大形成一叶状体，也在叶状体基部长出芽

发芽

根系的发育

芽分生组织的生长和发育

真叶的生长

芽和根的连接

正常植株生长

体细胞胚胎发生的实质是细胞分化的问题，而细胞分化的分子基础是基因表达与调控的结果

理论

阶段

通过生长素偶联和转运参与调节生长素水平的蛋白质的积累，包括吲哚-3-乙酸-酰胺合成酶（GH3）和肌动蛋白解聚因子（ADF2）等

与能量产生有关的蛋白、细胞壁重构蛋白、细胞内转运蛋白等的积累

糖蛋白的积累：如阿拉伯半乳糖蛋白

其他：类叶绿体蛋白、过氧化物酶、热休克蛋白、谷胱甘肽s-转移酶、晚期胚胎发生丰富蛋白等

在由植物愈伤组织诱导形成体细胞胚过程中，伴随着淀粉的合成，但不同时期淀粉的合成与积累不同

包埋在人工种子内部的体细胞胚或不定芽，植物自身的芽、腋芽、原球茎等，在一定条件下都能萌发生长，并形成完整植物的能力

人工胚乳为体细胞胚或不定芽，植物自身的芽、腋芽、原球茎等萌发和生长提供营养物质。

根据使用者的目的，可向人工胚乳内自由添加有利于胚状体正常萌发所需的各种营养成分、防病虫物质、植物激素等，也是人工种子优越于天然种子之处

包裹在人工种子的最外层，对人工种子起到保护作用，保护人工种子内部的水分和营养不致丧失和防止外部物理冲击，还要保证通气

裸露的或休眠的繁殖体，可以直接播种，如休眠的微鳞茎和微型薯等

人工种皮（聚氧乙烯等多聚体）包裹的繁殖体

水凝胶法包埋的体细胞胚、不定芽以及休眠的小鳞茎等繁殖体，水凝胶中可含有多种养分和激素，促进繁殖体的生长

液胶法包埋的繁殖体

进行包埋时应做到以下几点

包埋方法

目前美国杜邦公司生产的Elvax4260是一种较好的“人工种皮”材料，是由乙烯、乙酸和丙烯酸三种物质共聚的产物，用它作为人工种子最外层的包裹剂，即人工种皮取得较好的效果

将4g藻酸钙胶囊置于20ml含0.1g葡萄糖和含0.2ml甘油的氢氧化钠溶液中搅拌1min；在50ml环乙烷中加入10%的Elvax4260；在40摄氏度条件下溶解5g硬脂酸，10g鲸醋醇和25g鲸醋取代物，另加295ml石油醚和155ml二氯甲烷；将藻酸钙胶囊放在上述的混合液中浸泡10s，取出后用热风吹干。如此重复4-5次，最后用石油醚冲洗干净，经尼龙布过滤后在空气中风干即可

也称离体条件的转换。一般是将新制成的人工种子播种在1/4MS培养基，附加1.5%麦芽糖、8g/L的琼脂中，培养后统计人工种子形成完整植株的数目，即人工种子的转化率

无菌条件转换率的高低主要取决于

也称活体条件的转换。人工种子真正的目的是直接播种于土壤，即在活体条件下，是转换成功

土壤条件下转换采用方法

土壤条件的转换人工种子转化率低的主要限制因子

低温法

干燥法

抑制法

液体石蜡法

超低温储藏法

定义

特点

分批培养生长曲线及其各时期特点

继代方法

最佳继代时期

定义

可分为两种类型

作用

细胞计数、细胞体积、细胞鲜重、细胞干重

荧光素双醋酸酯法、台盼蓝染色法、四唑盐（MTT）比色法、酚藏花红染色法

1.在液体培养基中细胞或小细胞团分散性好，而小细胞团也仅在几十个细胞以下

2.均一性好。细胞形状、大小以及细胞团的大小表现均一致

3.生长迅速。细胞分裂旺盛、生长迅速，一般2-3天繁殖1倍

植物悬浮细胞系是原生质体培养和人工种子的研制奠定良好基础

为遗传转化提供了良好的受体

也可以用来生产植物次生代谢产物

一个成功的悬浮细胞培养体系必备的三个基本条件：细胞或小细胞团分散性好、均一性好、生长迅速

注意

悬浮细胞的分裂和分化通常有两个途径

悬浮细胞的培养方法

获取单细胞的方法

酚类化合物

含氮化合物

可以通过生物反应器进行大规模生产，实现生产工业化，提高次生代谢产物产量

由于采用生物反应器的生产系统和回收工艺，可以确保产物长期、连续和均匀的生产，不受天气、地理和季节等自然条件的限制

所获得的次生代谢产物的分离与纯化步骤要比直接从植物体内提取简单

可以通过细胞筛选，寻找原植物体内没有的其他有效成分

植物细胞生长缓慢，代谢产物含量低，成本高，而阻碍了植物细胞培养法在次生代谢产物生产上应用

生物转化是指以植物培养细胞为酶源，使某种前体化合物生成相应产物的技术，也叫植物细胞转化

1.细胞预冻；2.细胞在-196摄氏度下长期贮存；3.细胞解冻

冷冻诱导保护性脱水的超低温保存的方法，有冰晶的形成

概念

基本原理

优点

是在滴冻法和玻璃化法基础上发展起来的用于植物种质资源保存的新技术，即用装载液及玻璃化液对材料进行处理，而后将材料放在含有玻璃化液滴的铝箔纸上并投入液氮冻存的一种高效超低温保存方法

预培养的目的是提高分裂细胞的比例，减少细胞内自由水含量，增强细胞的抗冻能力

材料预培养的方法包括

保护剂的作用机制是增大膜对水分的通透性，促进细胞外冰冻造成的脱水效果，降低细胞内水分冰点温度，保护蛋白质和酶类

常用的冰冻保护剂大体分两类

1.快冻法是将材料从0摄氏度或其他预处理温度中直接投入液氮内

2.慢冻法：慢冻是指以0.1-10摄氏度/分钟的降温速度从0摄氏度降到-100摄氏度左右再立即浸入液氮

3.逐级冰冻法：培养物预冷却到-20、-50、-70、-100摄氏度停留一段时间后浸入液氮中

4.干冻法：采用无菌空气流、干燥硅胶或饱和溶液表面的气相等对材料进行脱水处理后快速将材料投入液氮贮存

5.玻璃化法：是由Sakai等建立的一种简单高效的冰冻保存方法

6.包埋玻璃化法：是将植物材料用褐藻酸钙包埋后，先在含高浓度蔗糖的培养基中脱水，再用无菌空气流或干燥硅胶脱水，然后投入液氮中保存，若用玻璃化保护及辅助脱水

7.小液滴玻璃化法

大量的实验表明，快速化冻法对大多数植物材料都适合，通常的做法是：将冻存后的材料放在25-40摄氏度的水浴中解冻，一旦冰完全融化后，立即取出材料以防热伤害和高温下保护剂的毒害

注意的问题