DNA合成原理课堂知识笔记
2022-10-20 11:46:25 0 举报AI智能生成
DNA合成原理课堂知识笔记
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大纲/内容
历史
寡核苷酸的化学合成起步于20世纪四十年代末
1955年，剑桥大学的Todd实验室成功合成了具有磷酸二酯键结构的TpT，并获得1957年诺贝尔奖
1965年，Khorana等利用化学方法大量合成脱氧核苷的单一聚合物或二种、三种脱氧核苷的重复序列，以及人工合成的六十四种核糖三糖苷，研究蛋白质的生物合成过程，从而确定了氨基酸的三联密码子，因此获得1968年诺贝尔奖
六十至七十年代，寡核苷酸的化学合成方法不断完善，逐渐形成了今天被广泛应用的固相亚磷酰胺三酯法并实现了合成的自动化
八十年代中后期，随着PCR技术的广泛应用，化学合成的寡核苷酸几乎进入了每一个分子生物学实验室，为PCR这一分子生物学及医学工作者的利器提供了刀锋
今天，世界上每天化学合成的寡核苷酸数以十万计，在HGP、基因治疗、基因芯片等生物医学热点中有着广泛的应用
基本材料
支持物
固相合成是将核酸固定在固相载体上完成合成反应的最常用的固相载体为可控微孔玻璃珠（CPG，controlleore glass），CPG的孔径根据所合成的寡核苷酸的长度而定，一般合成链长小于60mer时，选择孔径500埃CP
链长大于60mer时，使用1000埃CPG
使用CPG的偶联效率高达98%-99.9%，可以满足合成长达175mer2 的寡核苷酸的条件
CPG通过连接化合物与初始核苷酸的羟基共价结合，核苷酸的5’羟基用二甲氧基三苯甲基（DMT）保护
单体
3’位P上二异丙胺基，偶联所用的功能基
3’位P上腈乙基，保护基，合成完毕后脱去
5’-DMT，保护基，偶联前脱去
A和C的杂环氨基上的苯甲酸保护基，合成完毕后脱去
G上嘌呤环氨基上的异丙酰保护基，合成完毕后脱去
反应步骤
去封闭
活化
偶联
盖帽
氧化
合成后处理
切割
脱保护基
纯化
定量
储存
DNA寡核苷酸片段的纯化策略
寡核苷酸片段的应用目的
技术成本
是否具备某些设备
时间
预期产量
其他
脱盐
Cartridge（OPC）纯化
HPLC纯化
PAGE纯化
化学合成的Oligo用于克隆须知
内部缺失（n-1，n-2，etc）产物
Oligo DNA的化学合成是碱基与碱基之间通过化学反应偶联而成，而化学反应的偶联效率一般在99%左右
Oligo DNA的不完全脱保护，寡核苷酸的完全脱保护包括从磷酸酯基团、碱基上的环外氨基和5’-OH部分上去掉保护基团
不断延长的DNA链与不断减少的合成试剂会干扰oligo DNA的化学合成
单核苷酸的插入是存在于目的oligo DNA产物中的另一种常见的序列错误
OPC、HPLC特别是PAGE是产率损耗很大的纯化方法
常见问题
Oligo DNA制品的形态
如何稀释oligo DNA制品
怎样制备100μM 的储备液
Oligo DNA制品如何保存
Oligo DNA制品在常温下放置了一周还能正常工作吗
Oligo DNA制品可以用琼脂糖凝胶电泳检测吗
长度相同、碱基组成不同的oligo DNA进行变性PAGE电泳时，电泳带应该在同一位置吗
含有较长的连续鸟嘌呤的寡核苷酸可以合成吗
如何制备双链DNA
普通合成的oligo DNA 5’末端带磷酸基团吗
合成的Oligo DNA多次PCR无目的产物
常用简并oligo DNA（混合碱基）的代码
简并性oligo DNA对PCR扩增的影响
琼脂糖凝胶分析PCR产物时观察到非特异条带，为什么
进行反义DNA（antisense DNA）实验时，对DNA链是采取点硫代还是全程硫代修饰
PCR产物经克隆后测序发现oligo DNA处碱基有误，为什么
能保证合成的oligo DNA 100%正确吗
怎样保证合成Oligo DNA的高正确率
PCR产物可以直接克隆吗
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