Xenium Protocol for FFPE
2023-04-23 15:33:03 0 举报AI智能生成
Xenium Protocol In Situ Gene Expression
作者其他创作
大纲/内容
FFPE
制备FFPE蜡块（客户端制备）
可以进行相应组织块粗修
组织块比样本区域小，不用粗修
组织块大于样本区域但组织小于样本区域，可以修建组织周围石蜡
组织块和组织大小都大于样本区域，组织周围的石蜡可以被修剪，组织可以被分成更小的切片以适应样本面积
切片和贴片
Face the Block and Rehydrate
切开组织块，暴露组织
冰浴重新水化
Section the block
Float Section in water bath
Place section on the slides
Blank Slides
空白切片要求75*25*1 大小
Xenium Slides
过夜干燥后，进行后续脱蜡、解交联，含FFPE的slides常温干燥箱中保存4周
未拆封保存在-20
拆封后常温干燥箱保存1周
如果同一切片中贴多个组织，确保之前的组织不再淹没在水中
Deparaffinization and H&E Staining Imaging（QC）
tissue quality QC
脱蜡和解交联
Deparaffinization脱蜡
脱蜡流程
烤片2小时，室温冷却7min后，可以进行拍照，以便后续排查是否有脱片。
烤片后可以进行拍照，以便后续排查是否有脱片。
脱蜡最后，将slide组装于卡夹中
正确的组织卡夹，也是很重要
卡夹组装
Decrosslinking解交联
加入解交联试剂进行22度孵育前，安装卡夹盖子，然后盖上PCR仪再进行孵育。
去除解交联试剂后，进行3次PBS-T清洗，最后再加一次PBS-T
解交联后可以进行拍照，以便对比组织形状判定是否有脱片
如果只有1个正式芯片，在所有需要进行关闭热盖进行孵育的程序时，可以组装一个空白切片进行平行孵育。
解交联后立即进行探针杂交
探针杂交、连接和扩增（FF与之相同步骤）
探针杂交
预设探针only
人乳腺癌或是小鼠脑
预设探针+定制探针（不能单添加定制探针）
去掉一部分稀释buffer，与预设探针等体积添加即可
记录定制探针的ID 和相应slide NO.
热盖50℃或是关掉热盖
杂交16-24 h
杂交后清洗
取下卡夹，去掉盖子，去除杂交mix试剂
如果有2个slide，先去除并添加试剂，再做第2个，避免slide干燥。
立即加入500 ul PBS-T,室温孵育1min。去除PBS-T试剂
不要引入气泡
小气泡没有关系，不要吸或是戳破小气泡，容易导致脱片或是损失样本
重复上一步 1次
加入500ul杂交后清洗buffer，盖盖并上PCR仪 37℃孵育30min
结束后立即进行下一步
连接
取下卡夹，去掉盖子，去除清洗buffer试剂
如果有2个slide，先去除并添加试剂，再做第2个，避免slide干燥。
立即加入500 ul PBS-T,室温孵育1min。去除PBS-T试剂
重复上一步2次
加入500ul 连接mix，盖盖并上PCR仪37℃孵育2h
结束后立即进行下一步
扩增
取下卡夹，去掉盖子，去除连接mix试剂
如果有2个slide，先去除并添加试剂，再做第2个，避免slide干燥。
立即加入500 ul PBS-T,室温孵育1min。去除PBS-T试剂
重复上一步2次
加入500ul 扩增mix，盖盖并上PCR仪30℃孵育2h
扩增后清洗
取下卡夹，去掉盖子，去除扩增mix试剂
加入500 ul TE,室温孵育1min。去除TE
重复上一步1次
加入500 ul TE
进行下一步或是保存
进行下一步
安全停靠点：盖上盖子，4℃过夜或是不超过4天保存
保存期间，不要开盖
自荧光淬火
目的：减少由于醛固定、红细胞以及胶原蛋白/弹性蛋白结构造成的自发荧光
取下卡夹，去掉盖子，去除TE
如果有2个slide，先去除并添加试剂，再做第2个，避免slide干燥。
加入1000ulPBS,室温孵育1min，去除PBS
再重复上述步骤2次
500ul加入 稀释过的Reducing Agent B，盖盖，室温孵育10min。
取下卡夹，去掉盖子，去除Reducing Agent B
加入1000ul 70%乙醇，等1min，弃掉。
加入1000ul 100%乙醇，等1min，弃掉
重复上一步1次
立即加入500ul Autofluorescence Solution ，盖盖，黑暗条件下室温孵育10min
去掉盖子，去除Autofluorescence Solution
加入1000ul 100%乙醇，等2min，弃掉
再重复上一步2次
将卡夹放置于PCR仪上，进行37℃ 5min烘干，卡夹不盖盖子同时PCR仪不盖盖。
不要干透
立即取下卡夹，并加入1000ul PBS重新水化组织，并黑暗条件下室温孵育1min。去除PBS
加入1000ul PBS-T，黑暗条件下室温孵育2min
可以进行拍照，以便对比组织形状判定是否有脱片
保存或继续进行
保存：安全停靠点，盖上盖子，4℃黑暗条件下保存不超过4天
保存期间，不要开盖
继续实验（推荐继续）
核染
去除PBS-T，加入500ul Xenium Nuclei Staining Buffer，黑暗条件下室温孵育1min
去除Nuclei Staining Buffer，加入1000ul PBS-T，黑暗条件下室温孵育1min
再重复上一步2次
加入1000ul PBS-T，保存或继续
保存：安全停靠点，盖上盖子，4℃黑暗条件下保存不超过4天
保存期间不要开盖
继续进行实验
什么核染染料？
解码和拍照分析（FF与之步骤相同）
DAY1
解冻解码试剂
Decoding Module A
实验前密封袋中4度过夜解冻（氧敏感）
实验前密封袋中4度过夜解冻（氧敏感）
未拆封的A 试剂，4度最多保存3天
从包装中取出后5天内必须使用（含运行时间）
从4度取出后，轻柔反转20次混匀来进行混匀，不要震荡，然后冰上保存。
准备空板，加水制备配平板，±1g的波动
300g 室温离心1min
离心完后上机前，一直4度保存直到loading
Decoding Module B
实验前密封袋中4度过夜解冻
从4度取出，室温平衡30min
从4度取出后，轻柔反转20次混匀来进行混匀，不要震荡，室温保存。
准备空板，加水制备配平板，±1g的波动
300g 室温离心1min
离心完后上机前，一直常温保存直到loading
DAY2
准备buffer
Deionized Water/Xenium Instrument Wash Buffer
Milli-Q Water
500ml
Xenium Sample Wash Buffer A
不要用磁力搅拌器或是剧烈摇匀
保证最小的气泡
PBS + Tween（粉末或是液体）
1L
Xenium Sample Wash Buffer B
Milli-Q Water
500ml
Xenium Probe Removal Buffer
DMSO + Tween + KCl
不要用磁力搅拌器或是剧烈摇匀
保证最小气泡
300ml
设备初始化
按住右侧开关
长按3秒以上
输入实验细节
屏幕上点击Start New Run”
机器自检3min
输入 Run Name 、Cassette Name、Slide ID、Panel File
设备加载
加载各项耗材
检测各项准备是否完成（√）
卡夹（贴好组织的 Xenium slide）
试剂buffer 瓶（装有buffer并盖上专业的盖子）
Objective Wetting Consumable
Reagent Plate
Pipette Tip Rack
Extraction Tip
废枪头盒
样本扫描（1h）
初始扫描用于区域全选
确保远离震动
确保不与设备发生相互作用，不触碰键盘或是触摸板
圈选和启动运行
点击添加区域按钮
区域选择
区域大小：最小为1个FOV，最大为整个区域
每个slide至少选择1个区域
每个组织都是单独的区域
如果大于8个区域，建议合并为1个区域。高数目的区域会增加运行时间
如果不确定FOV是否属于一起，需要选择所有位置作为一个区域
一个区域内FOV不一定是连续的
不能允许出现overlap的情况，如果有则需要两个区域中排出掉重叠区域。
圈选的原则
DAY4-6
运行
确保耗材全部在位
确保远离震动
点击 Start Run
界面4色颜色状态
蓝色：运行中
绿色：运行结束
黄色：运行未完成
红色：运行失败
运行后清洁
点击启动“Cleanup”
结束后，点击“Continue”
卸载
打开机器前面面板
移除所有耗材并切掉所有的固体和液体的垃圾
弃掉耗材无需按照相应顺序
H&E染色（post Xenium RUN）
可选
FF
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职业：PM-本科
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