肿瘤耐药研究流程
2023-12-21 19:54:27 0 举报肿瘤耐药研究流程
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大纲/内容
Rescue实验：证明基因和表型之间的因果关系1.基因和疾病表型具有相关性；2. 去除基因，疾病表型减弱；3. 重新过表达该基因，被减弱的表型再次恢复（rescue）。
表型研究
上游基因A→···→目标基因→下游基因B→···→耐药
根据已有研究寻找目标基因：已知在其他癌种中介导耐药但在肺癌中还未研究，或组织特异性基因
目标基因的蛋白水平与药物敏感性的相关性
体外验证：在细胞水平改变基因表达水平，通过PCR、western blot等技术观察关键蛋白水平的变化
临床转化
CRISPR-Cas9本质是，将观察到的表型和被敲除的基因的信息进行对应，借此推测该基因所具有的功能。CRISPR文库是基于CRISPR-Cas9技术建立的高通量基因筛选方案；经正向筛选，绝大部分细胞因对药物敏感而死亡，部分细胞由于发生特定基因敲除产生抗药性而存活，检测存活细胞携带的gRNA。
应用以上2步扩大药物范围，提高研究的广度和意义
肿瘤耐药相关基因的研究流程
机制探索
通过CRISPR文库/CRISPR-Cas9筛选肿瘤耐药相关的基因
体内验证：建立小鼠荷瘤模型，诱导目标基因过表达/敲减目标基因（或上下游基因），观察肿瘤体积、重量等
在低表达目标基因（对药物敏感）的细胞中过表达这一基因，观察是否诱导耐药
筛选目标基因
筛选抑制目标基因的分子/药物，改善耐药
临床验证：对接受某种治疗的患者的肿瘤组织进行免疫组化（区分目标基因的不同表达水平），进行生存分析。+TCGA等数据库的生存分析
根据抗肿瘤药物的作用机制及现有研究进行推测：目标基因可能影响药物发挥作用过程中的某些环节
RNA-seq：目标基因过表达细胞VS对照细胞。将目标基因过表达细胞中下调的基因与CRISPR富集基因进行比较，筛选目标基因发挥作用的上下游基因
机制验证
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